miR319a2在調(diào)節(jié)白菜葉球形狀中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及miR319a2在調(diào)節(jié)白菜葉球形狀 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)今農(nóng)業(yè)上的蔬菜品種從食用部位來看，可以分為葉類蔬菜，根莖類蔬菜和果實 類蔬菜。其中在葉類蔬菜中，葉球類蔬菜是一個重要的組成部分，其中較為常見的有結(jié)球白 菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis),結(jié)球甘藍（Brassica oleracea L. var. capitata L)和結(jié)球生菜（Lactuca sativa var.capitata L.)。結(jié)球白菜（又稱大白菜），是亞洲地 區(qū)傳統(tǒng)的蔬菜作物
[0003] 葉球作為該類蔬菜的儲存器官，是其可食用部分，具有重要的農(nóng)業(yè)價值和商品價 值。從形態(tài)上看，葉球是一種變態(tài)器官，由輪生的葉片相互抱合而成，葉子向內(nèi)彎曲是葉球 發(fā)生的顯著特征。
[0004] 已經(jīng)知道，許多因素會影響植物葉球的發(fā)生和發(fā)育過程。生長素在葉片內(nèi)的不均 衡分布、較低的溫度和較大的晝夜溫差、弱光、短日照以及充足的碳素營養(yǎng)都可以促進葉球 的發(fā)生和發(fā)育。因此，葉球的發(fā)生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，是在環(huán)境因子誘導(dǎo)下的形態(tài)學(xué) 反應(yīng)。在此過程中表達的基因是調(diào)控植物接受外界信號和展開發(fā)育活動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0005] 以大白菜為例，在栽培條件下，大白菜需要一個長時間的營養(yǎng)生長來形成葉球，通 常這個時期可以分為4個部分：幼苗期，蓮座期，包心期和結(jié)球期，通過葉形態(tài)的特點來劃 分。在幼苗期，幼態(tài)葉生長并分化為成熟葉；在蓮座期，展開的葉片通過提供光合作用產(chǎn)物 的方式輔助葉球形成。包心的葉片分化并向內(nèi)彎曲為葉球形成提供架構(gòu)和遮蔽，而葉球的 葉片緊緊地圍繞莖尖形成儲存營養(yǎng)物質(zhì)的葉球。
[0006] 由于葉球是大白菜的主要食用器官，因此大白菜葉球發(fā)育的好壞決定了大白菜 的品質(zhì)和農(nóng)業(yè)價值。我國育種家采用傳統(tǒng)的育種方法廣泛開展大白菜類蔬菜品種的選育 工作，擴大資源來源途徑，開展多種品種間的雜交組合，一定程度提高了白菜類蔬菜葉球性 狀，并選育了大量抗蟲抗病，快速生長的品種，在生產(chǎn)上已經(jīng)發(fā)揮了作用。然而，傳統(tǒng)的育種 學(xué)在原有的基礎(chǔ)上進行品種的優(yōu)選優(yōu)育，但由于現(xiàn)有品種的局限性，傳統(tǒng)的配置雜交組合 的育種方法受到了一定的限制性，為了適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，采用新的技術(shù)手段來開發(fā)更 為早熟，結(jié)球品種更為多樣化的的大白菜品種變得日益重要。此外，除了大白菜以外，對結(jié) 球甘藍，結(jié)球生菜等其他葉球類蔬菜的葉球農(nóng)業(yè)性狀的改良，也具有十分重要的意義。
[0007]microRNA(miR或miRNA，微小RNA)是一類在較高等的真核生物體內(nèi)廣泛存在的， 長度約18-26個堿基的單鏈RNA分子。它可以通過堿基配對原則特異性地與一些mRNA上 的靶位點相結(jié)合，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，進而在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因進行調(diào)控。
[0008]microRNA來源于長度約lOOObp的長鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在細胞核中經(jīng)Drosha酶剪切形成長度約60-80nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA 前體。前體miRNA轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)后，被進一步切割成長約18-26nt的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA 解開后，成熟的miRNA進入RNA誘導(dǎo)基因沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，與互補mRNA完全或不完全配對，降解靶mRNA或阻遏其表達。盡管microRNA在細胞 總RNA中所占的比重很小，但由于它可以高效地對所有具有靶位點的mRNA產(chǎn)生調(diào)控作用， microRNA在農(nóng)作物品質(zhì)改良中所起的作用不可小視。
[0009] 迄今為止，本領(lǐng)域?qū)τ谟绊懓撞巳~片和葉球形狀性狀相關(guān)的基因或調(diào)控機理了解 甚少，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)調(diào)節(jié)白菜葉球形狀的物質(zhì)及其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種可調(diào)節(jié)白菜葉球形狀的物質(zhì)、手段及其應(yīng)用。
[0011] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種微小RNA-miR319a2,所述的miR319a2具有如 SEQIDN0. :1所述的序列。
[0012] 在本發(fā)明的第二方面，提供了 一種用于產(chǎn)生本發(fā)明第一方面所述的微小 RNA-miR319a2的多核苷酸，所述的多核苷酸是序列如SEQIDN0. :3所示的編碼序列。
[0013] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種miR319a2、或miR319a2活性片段、或miR319a2 的拮抗劑、或miR319a2的激動劑的用途，它們被用于調(diào)控白菜葉片的細胞分裂和/或調(diào)控 白菜葉球形狀。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的白菜包括大白菜、小白菜、甘藍、生菜。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的大白菜選自下組：結(jié)球白菜（Bre)。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控白菜葉片的細胞分裂是指：調(diào)控白菜葉片的細胞分 裂速度。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控白菜葉片的細胞分裂是增強白菜葉片的細胞分裂速 度。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控白菜葉球形狀是指：調(diào)控白菜葉球形狀的葉球高度、 葉球直徑、以及葉球指數(shù)（即葉球高度直徑比）。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的miR319a2具有如SEQIDN0. : 1所述的序列：
[0020] 5,-UUGGACUGAAGGGAACUCCCU-3,（SEQIDN0. :1)。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述用途還選自下組：還包括調(diào)控白菜的葉邊緣結(jié)構(gòu)、調(diào)控白菜 的葉面泡狀結(jié)構(gòu)、調(diào)控白菜的莖尖（頂端分生組織）的發(fā)育、或其組合。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述miR319a2的拮抗劑包括與miR319a2結(jié)合的海綿體、反義寡 聚核苷酸（如SEQIDN0. : 1的反義序列）、鎖核酸、或抑制miR319a2表達的物質(zhì)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑是序列如SEQIDN0. :2所示的核苷酸序列；或由 SEQIDN0. :2序列的串聯(lián)形成的海綿體。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述miR319a2的激動劑為：促進miR319a2高表達（或超表達） 的物質(zhì)。
[0025] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種調(diào)控白菜葉球形狀的方法，所述方法包括步驟 ： 將表達miR319a2的表達載體導(dǎo)入所述白菜，從而在轉(zhuǎn)基因的白菜中表達miR319a2。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對所述轉(zhuǎn)基因的白菜，進行葉球形狀測定，并 與野生型白菜的葉球形狀進行比較。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對所述轉(zhuǎn)基因的白菜，測量BrpTCP基因的表 達水平。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的葉球形狀測定包括測量葉球高度、葉球直徑、以及葉球高 度直徑比。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的葉球形狀測定包括測量白菜的葉邊緣結(jié)構(gòu)、或調(diào)控白菜 的葉面泡狀結(jié)構(gòu)。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對于選出的葉球形狀發(fā)生變化（或預(yù)定變化） 的白菜，測定其生長速度，從而挑選出改良的白菜品種。
[0031] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，所述的載體攜帶表達本發(fā)明第一方面所 述的微小RNA-miR319a2的核酸序列。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸序列是序列如SEQIDN0. :3所示的核苷酸序列。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體為表達載體。
[0034] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種植物細胞，所述的植物細胞含有本發(fā)明第五方 面所述的載體，或者其基因組中整合有表達本發(fā)明第一方面所述的微小RNA-miR319a2的 核酸序列。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物細胞是葉球類植物細胞，較佳地是白菜的細胞。
[0036] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一贅述。
【附圖說明】
[0037] 下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的 本發(fā)明范圍。
[0038] 圖1顯示了擬南芥與大白菜的Brp-MIR319a和BrpTCP基因家族序列比對分析。其 中包括At_miR319a、Brp-miR319al和Brp_miR319a2等序列。
[0039] 圖2顯示了結(jié)球白菜不同葉球的表型以及miR319a2基因?qū)Π撞巳~球形態(tài)的影響。 其中，圖2A-2H為從結(jié)球白菜-不結(jié)球白菜重組自交系F6代植株中分離的四種大白菜葉 球表型。（2A)圓形葉球白菜，及其葉球（2E)，（2B)橢圓形葉球白菜，及其葉球（2F)，（2C) 圓柱形葉球白菜，及其葉球（2F)，（2D)圓錐葉球白菜，及其葉球（2F)，（21)野生型大白菜 品系Bre，及其葉球（2J)和頂端分生組織橫切面（2K)，（2L)Bre與319a2轉(zhuǎn)基因大白菜球 葉，（2M)Brp-MIR319a2轉(zhuǎn)基因大白菜株系319a2-2,及其葉球（2N)和頂端分生組織橫切面 (20)，（2P)319a2轉(zhuǎn)基因大白菜葉邊緣融合現(xiàn)象，及其切片（2Q)。
[0040] 圖3顯示了轉(zhuǎn)基因大白菜319a2的表型。（3A)野生型和轉(zhuǎn)基因大白菜319a2中 miR319a的Northern雜交，（3B)野生