一種特異識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到利用一種SELEX技術(shù)（指數(shù)富集的配體系 統(tǒng)進化技術(shù)）制備一種與棒曲霉素高特異性和高親和力的核酸適配體，為該核酸適配體在 快速檢測棒曲霉素提供基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] 棒曲霉素（Patulin)是由青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬產(chǎn)生的真菌代謝產(chǎn)物，主要在 蘋果及其制品中常見。棒曲霉素對熱穩(wěn)定，l〇〇°C加熱15分鐘仍然不能破壞其結(jié)構(gòu)，且在酸 性溶液及有機溶劑中能長期保存。棒曲霉素曾因為其抑制多種菌生長而被用作抗生素，它 具有引起抽搐、腸道出血、肺部出血、腎臟損害等急性毒性，同時具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、 基因毒性、致畸、致癌等慢性毒性。目前檢測棒曲霉素的方法有：薄層層析法（TLC)、高效液 相色譜法（HPLC)、液相色譜法（IX)、反相高效液相色譜（reveresed-phaseHPLC)、色譜聯(lián) 用技術(shù)（GC/MS，LC/MS)、酶聯(lián)免疫法（ELISA)等。這些方法檢出限低、精密度高，但操作復(fù) 雜、檢測成本高。構(gòu)建一種快速、簡單、低成本的棒曲霉素檢測方法有重要意義。
[0003] 適配體是一種能以高親和力與各靶分子特異結(jié)合的單鏈寡核苷酸，一般通過 指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（SystematicEvolutionofLigandsbyExponential Enrichment,SELEX)篩選得到。適配體以其從體外制備、高親和性、高特異性、獲得方便、易 修飾等的優(yōu)勢引起了國內(nèi)外科研人員的廣泛研究。目前對于小分子物質(zhì)的適配體篩選方 法主要有親和層析法、磁珠法、毛細管電泳法等，主要通過將靶分子活化后固定在固載物質(zhì) 上，從而將與靶分子結(jié)合的適配體分離出來。這種方法對靶分子結(jié)構(gòu)有較高的要求，即其結(jié) 構(gòu)中含有易活化基團，并且活化之后對原結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較小的變化和影響。氧化石墨烯可以通 過ji-ji堆疊作用吸附ssDNA，但不易吸附與靶分子結(jié)合而產(chǎn)生構(gòu)象折疊后的ssDNA，可以 用來分離與靶分子結(jié)合的適配體。
[0004] 在發(fā)明中，將氧化石墨烯作為SELEX篩選的分離方法，避免改變小分子棒曲霉素 的結(jié)構(gòu)，避免活化將其固定于載體上，只需直接利用氧化石墨烯對ssDNA的強吸附作用，將 未與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA去除，實現(xiàn)對直接對天然的棒曲霉素的適配體的篩選。獲得高親和 性高特異性與棒曲霉素結(jié)合的寡核苷酸適配體后，可將其化學(xué)修飾，用于發(fā)展簡單便捷的 檢測棒曲霉素的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種對完整靶分子檢測方法，特別涉及一種能特異結(jié)合棒曲 霉素的適配體，為發(fā)展快速、便捷檢測棒曲霉素的方法奠定基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明方法利用指數(shù)級富集配體的系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX技術(shù)），以氧化石墨烯為 分離方法，無需將靶分子固定在載體上，以棒曲霉素完整的結(jié)構(gòu)為靶標(biāo)，篩選獲得與靶分子 高親和性特異結(jié)合的適配體。最終通過12輪的篩選，獲得與棒曲霉素高親和性高特異性結(jié) 合的最佳寡核苷酸適配體。
[0007] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0008] 與抗體和酶相比，避免了傳統(tǒng)抗體制備中動物實驗過程，而直接從體外文庫中選 擇；適配體對體外篩選靶分子顯示出高特異性和親和力，目標(biāo)范圍廣；獲得方便，合成的重 現(xiàn)性好，通過化學(xué)合成和修飾可以增強其穩(wěn)定性；化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，保存時間長；避免將小 分子靶標(biāo)固定在載體上；避免小分子靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)變化。
【附圖說明】
[0009] 圖1是PAT-11寡核苷酸適配體的模擬二級結(jié)構(gòu)圖。
[0010] 圖2是PAT-11寡核苷酸適配體的飽和結(jié)合曲線圖。
[0011] 圖3是PAT-11寡核苷酸適配體的特異性試驗結(jié)果。
【具體實施方式】：
[0012] 以下是通過SELEX技術(shù)篩選特異結(jié)合棒曲霉素的核酸適配體的進一步說明。
[0013] 1、合成隨機單鏈DNA文庫和引物（IDT公司合成）
[0014]隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫：5 ' -CAGCTCAGAAGCTTGATCCT(N40) GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3 '，構(gòu)建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固 定引物序列，中間為40個堿基的隨機序列，庫容量為1014以上；上游引物I: 5'-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3，；下游引物II:5，-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3，，將隨機 ssDNA文庫和兩種引物均用TE緩沖液配制成100ymol/L貯存液-20°C貯存?zhèn)溆谩?br>[0015] 2、ssDNA的制備及純化
[0016]反應(yīng)體系為：模板DNA L, FAM標(biāo)記上游引物1 ii L(20mM),磷酸化下游引物 0? 5 ii L (20mM)，dNTPmix (25mM) 0? 5 ii L, 10 X PCR擴增緩沖液5 ii L,滅菌超純水37. 5 ii L，Taq 酶0. 5 ii L，總體積為50 ii L。PCR擴增程序：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;53°C退火30s ; 72°C延伸20s ;循環(huán)25次；最后72°C延伸2min。PCR擴增后得到的產(chǎn)物通過8%非變性聚 丙烯酰胺凝膠進行電泳確認(rèn)電泳條帶是否正確，是否單一。取條帶正確且?guī)螁我坏腜CR 產(chǎn)物溶液，用DNA純化試劑盒（Generay)進行純化，溶于滅菌超純水。再加入1/10體積的 10 X lambda酶切反應(yīng)緩沖液混合均勻，在37°C下反應(yīng)40min，再75°C水浴lOmin使酶失活 停止反應(yīng)。使用含7M尿素的變性8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，確認(rèn)電泳條帶是否正確，是 否單一。
[0017] 將條帶位置正確且?guī)螁我坏拿盖挟a(chǎn)物匯集在一個離心管中，等體積的酚：氯 仿：異戊醇（V:V:V= 25:24:1)混合液，在旋渦混合器上混勻管內(nèi)容物使之呈乳狀， 2000rpm、4°C離心5min，再8000rpm、4°C離心lmin，吸取上清。在得到的上清液中加入1/10 體積的3M醋酸鈉（pH5. 2)溶液及2倍體積的無水乙醇，漩渦震蕩儀充分混勻30s后置 于-20°C冰箱內(nèi)過夜。取出后，13000rpm，4°C離心15min，離心管底部出現(xiàn)淡黃色沉淀，棄上 清，加入4°C預(yù)冷的70%乙醇上下顛倒洗漆，再14000rpm、4°C離心5min后棄上清，打開蓋子 將沉淀置于50°C烘箱至烘干，溶于滅菌TE緩沖液中，通過One-drop分光光度計測定ssDNA 濃度。
[0018] 3、G0篩選方法
[0019] 本發(fā)明利用氧化石墨烯對ssDNA強吸附作用來實現(xiàn)去除未能與靶標(biāo)結(jié)合的 ssDNA。實驗中，將靶分子棒曲霉素溶于乙酸乙酯，配為0.lmg/ml的溶液存于-20°C，每次取 出后用氮氣吹干，再加入試劑使用。
[0020] 首輪孵育時，加入隨機ssDNA文庫2nmol，其余每輪ssDNA文庫（由上一輪制 備）加入量為200pmol，每輪靶標(biāo)加入量為2nmol。每一輪孵育體系為300iil，在Binding Buffer(50mMTris，pH7.4，150mMNaCl，2mMMgC12)中孵育，25°C孵育一段時間后，加入GO 進行吸附30min,再14000rpm,lOmin離心取上清。每一輪孵育后所得到上清液作為模板進 行PCR擴增，擴增所得DNA經(jīng)過純化、酶切、純化得到ssDNA作為下一輪篩選的文庫。
[0021] 富集到一定程度后，加入類似毒素黃曲霉毒素B1、伏馬菌素B1、赭曲霉毒素A、T_2 毒素、玉米赤霉烯酮進行反篩，以去除低特異性的ssDNA。即先將ssDNA與反篩分子進行孵 育2h，加入氧化石墨烯G0,則未與反篩分子結(jié)合的ssDNA被吸附到G0表面。接下來清洗 G0,再將其重懸與BB中，加入棒曲霉素，孵育2h。孵育后離心收集孵育液，進行PCR擴增，純 化，制備單鏈，作為下一輪篩選的單鏈文庫。
[0022] 4、克隆和測序
[0023] 將第十二輪富集的ssDNA文庫，PCR擴增為雙鏈，送上海生物工程有限公司進行 DNA序列測定，獲得適配體序列。
[0024] 5、適配子序列結(jié)構(gòu)分析
[0025] 采用DNAMAN軟件和RNAStructure4. 2軟件對適配體序列進行一級結(jié)構(gòu)和二級 結(jié)構(gòu)分析。如圖1所示，適配體中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能是適配子與靶分子結(jié)合的基 礎(chǔ)。
[0026] 6、適配子與棒曲霉素親和力和特異性測定
[0027] 6. 1適配體親和力分析
[0028] 將適配體序列5 '端標(biāo)記FAM，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用于 親和力測定。
[0029] 將適配體用BindingBuffer稀釋為不同的濃度梯度（5, 25, 50, 100, 125, 200nmol/ L)，與lnmol棒曲霉素在25°C孵育2h，再用氧化石墨烯吸附并淬滅未與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA。 孵育在25°C搖床中進行，將孵育液用F-7000熒光光譜儀，檢測熒光強度。利用GraphPad Prism5. 0軟件繪制飽和曲線，并計算解離常數(shù)Kd值。如圖2所示。
[0030] 6. 2適配體特異性分析
[0031]分別加入lnmol棒曲霉素（Patulin)，黃曲霉素B1(AflatoxinB1)，伏馬菌素 Bl(FumonisinB1)，赭曲霉毒素（Ochratoxin)，單端孢霉烯族化合物T-2毒素，玉米赤霉烯 酮（Zearalenone)，與FAM標(biāo)記適配體進行25°C搖床孵育2h后，加入G0吸附并淬滅未結(jié) 合的熒光標(biāo)記ssDNA，25°C搖床孵育30min后將孵育液進行熒光檢測。如圖3所示，表明 PAT-11適配體與棒曲霉素的特異性良好。因此，利用SELEX技術(shù)篩選的棒曲霉素高親和性 特異核酸適配體檢測棒曲霉素，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項】
1. 特異識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體，具有序列表1所示的核苷酸序列。
2. 按權(quán)利要求1中所述的適配體，其特征在于，所述序列為人工合成的序列，或任何其 他來源的同樣的序列。
3. 特異性識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體，包括對權(quán)利要求1所述適配體序列經(jīng)替 換、缺失和/或插入一個或幾個核苷酸形成的具有相同功能的序列。
4. 特異性識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體，包括以權(quán)利要求1所述適配體序列為核心 序列并在兩邊或任一單邊延伸的序列。
5. 特異性識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體，包括對權(quán)利要求1所述適配體序列的5' 端或3'端連接或標(biāo)記其他功能基團或分子，并與權(quán)利要求1所述適配體具有相同功能的適 配體序列，所述其他功能基團或分子包括：生物素、氨基、巰基、熒光素、地高辛、放射性同位 素、酶標(biāo)記、納米發(fā)光材料等。
6. 特異性識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體，包括對權(quán)利要求1所述適配體序列進行化 合物修飾的序列，以增強其半衰期、提高其穩(wěn)定性、防止核酸內(nèi)切酶或外切酶切割。
7. 按權(quán)利要求1-6中任一項所述的適配體，其特征在于，所述序列單獨或聯(lián)合使用均 能用于棒曲霉素的分析檢測。
8. 按權(quán)利要求1-6中任一項所述的適配體，其特征在于，所述序列在分離富集或分析 檢測棒曲霉素中的應(yīng)用。
9. 按權(quán)利要求1-6中任一項所述的適配體，其特征在于，所述序列在棒曲霉素中毒診 斷中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棒曲霉素的寡核苷酸適配體。通過基于氧化石墨烯的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)，獲得了能夠特異識別棒曲霉素的單鏈寡核苷酸適配體，該適配體可以通過標(biāo)記功能基團等轉(zhuǎn)為報告適配體，用于檢測棒曲霉素，該適配子序列在準(zhǔn)確、快速檢出食品中的棒曲霉素具有廣泛應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N15-115, G01N1-40, G01N33-53
【公開號】CN104593374
【申請?zhí)枴緾N201510092444
【發(fā)明人】王周平, 張維瀟, 段諾, 吳世嘉, 夏雨
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年3月2日