一種hPXR介導(dǎo)的雙螢光素酶報告基因技術(shù)高通量藥物篩選模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域，具體地說本發(fā)明涉及一種篩選人孕烷X受體激動劑和拮抗劑的方法，利用該方法可以篩選能夠?qū)XR的靶基因——細胞色素CYP450基因產(chǎn)生的調(diào)控作用的活性藥物配體，可應(yīng)用于新藥篩選。
【背景技術(shù)】
[0002]PXR屬核受體NRlI亞家族，人的PXR基因含10個外顯子和9個內(nèi)含子，全長約35kb。1998年3個研究組分別用同源克隆和數(shù)據(jù)庫技術(shù)在人和小鼠中獨立地發(fā)現(xiàn)孕烷活化受體、類固醇及外源性物質(zhì)受體PXR，因其能被高濃度的孕激素激活，故獲此命名，有時也被稱為類固醇與外源活性物受體(steroid xenob1tic receptor, SXR) IXR能調(diào)控的功能蛋白涉及到藥物分布、代謝及轉(zhuǎn)運等多個環(huán)節(jié)，包括I相的代謝酶:CYP3A、CYP2B與CYP2C ；II項代謝酶:谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶；藥物轉(zhuǎn)運體:多藥耐藥蛋白-1，多重耐藥蛋白-1，有機陰離子轉(zhuǎn)運體多肽_2。其所調(diào)控的CYP450酶的亞型主要是CYP3A家族，PXR對CYP3A表達的調(diào)控機制為:藥物進入細胞漿的藥物作為PXR的配體與其結(jié)合活化PXR，令PXR活化后，藥物-PXR受體復(fù)合物再與視黃醛X受體(retinoid Xreceptor, RXR)形成異源二聚體后，作用于CYP3A的基因上游調(diào)控序列近端啟動子序列和遠端增強子序列中的ER-6及DR-3元件，上調(diào)CYP3A基因的表達，引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)。
[0003]近年來，越來越多的PXR天然藥物激動劑被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，天然藥物例如圣約翰草，銀杏(Ginkgo biloba),穆庫爾沒藥油狀樹脂(Commiphora mukul),五味子(Schisandrachinensis),甘草(Glycyrrhiza uralensis),丹參(Salvia milt1rrhiza)及天仙(Dutchmanspipe Vine)等具有能激活PXR的能力。因此，闡明草藥-藥物相互作用的分子機制來阻止不良反應(yīng)的發(fā)生是尤為必要，同時對于利用PXR配體闡明某些天然藥物的對疾病的治療作用也具有極其重要的臨床意義。
[0004]然而激動PXR后，由于影響代謝酶和轉(zhuǎn)運體的表達即獲刑，往往產(chǎn)生非預(yù)期的不利影響。為了改善PXR激動劑產(chǎn)生的不良藥物相互作用級抗癌藥物由于活化PXR產(chǎn)生的藥物耐藥性，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)了可以拮抗PXR激動作用的PXR拮抗劑，例如ET-743、二甲雙胍、香豆雌酚及酮康唑等唑類抗真菌藥。由于PXR拮抗劑可以通過拮抗配體的活化作用，來抑制配體對藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運體的誘導(dǎo)作用，從而降低不良DDI的發(fā)生，以及逆轉(zhuǎn)抗癌藥的耐藥性，故尋找新的PXR拮抗劑具有重要的臨床意義。
[0005]目前，針對核受體包括hPXR的藥物篩選手段包括:基于細胞的轉(zhuǎn)錄激活檢測法、基于溶液的生物物理化學(xué)分析和基于計算機輔助的虛擬篩選等。相對而言，前者因基于生理狀態(tài)更為有效。高通量篩選技術(shù)已成為目前藥物篩選領(lǐng)域研究的重要課題，針對靶標的藥物研發(fā)過程可以分為靶標的確立，先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，新藥的研發(fā)。其中高通量篩選技術(shù)是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵，在藥物研發(fā)過程中起重要作用，由于其具有快速、微量、高效、經(jīng)濟的特點，這一技術(shù)必將在未來的藥物研究中發(fā)揮越來越重要的作用。而基于細胞的轉(zhuǎn)錄激活檢測的報告基因篩選模型為高通量尋找新藥提供了可能，通過將目的基因與雙報告基因共轉(zhuǎn)染入細胞中進行表達，配體結(jié)合到相應(yīng)的受體，激活下游信號通路，報告基因響應(yīng)這種信號的變化，使熒光素酶表達量發(fā)生變化。通過檢測細胞中雙報告基因熒光素酶的表達，來評估配體的功能和進行備選藥物的高通量篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是在于提供一種操作簡單、特異性好的可用于篩選調(diào)控人孕烷X受體(hPXR)活性的藥物的高通量篩選方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明將該方法應(yīng)用于人胚腎HEK293T細胞，簡歷一種快速篩選hPXR激動劑和拮抗劑的方法，該方法包括如下步驟:
I)將處于對數(shù)生長期的人胚腎HEK293T細胞進行消化，將細胞吹打均勻后按適當(dāng)密度接種于96孔板中；細胞種板后放入細胞培養(yǎng)箱中，12~16個小時后，至細胞在96孔板中覆蓋率達到60~80%即可進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
[0008]2)篩選激動劑模式
轉(zhuǎn)染4-6小時后，對已轉(zhuǎn)染的細胞分別加入適量含藥培養(yǎng)基進行孵育，設(shè)置陰性對照組、陽性激動對照組和受試藥物組，孵育24~48小時后進行雙熒光報告基因檢測。
[0009]3)篩選拮抗劑模式
轉(zhuǎn)染4-6小時后，對已轉(zhuǎn)染的細胞分別加入適量含藥培養(yǎng)基進行孵育，設(shè)置陰性對照組、陽性激動對照組、陽性拮抗組和受試藥物組，孵育24~48小時后進行雙熒光報告基因檢測。
[0010]所訴步驟I)中的質(zhì)粒為hPXR表達質(zhì)粒、螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參比海腎螢光素酶質(zhì)粒。
[0011]所訴步驟I)中質(zhì)粒中的螢火蟲螢光素酶報告基因質(zhì)粒為含有CYP3A4啟動子區(qū)域的報告基因質(zhì)粒。
[0012]所訴步驟2)中的陽性激動對照組選用利福平作為陽性激動劑，優(yōu)選濃度為10~50μ molL 、
[0013]所訴步驟3)中的陽性拮抗對照組選用酮康唑作為陽性拮抗劑，優(yōu)選濃度為25~100μ molL 、
[0014]所訴步驟2)和步驟3)中的雙螢光素酶報告基因檢測按照P1mega公司雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒進行操作:
I)去除培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌細胞I次，然后用一次性注射器小心去除PBS溶液，每個培養(yǎng)孔中加入100 UL I XPLB溶液，室溫下震蕩15 min。
[0015]2)提前將20 UL LARII溶液加入到報告基因檢測試管底部中，轉(zhuǎn)移震蕩后的裂解產(chǎn)物100 μ L LARII液體內(nèi)，用槍吹打6-7下后，用化學(xué)發(fā)光檢測螢光素酶活性，再迅速加入100 uL Stop & GloReagent,渦旋3秒后混勻后進行海腎螢光素酶活性檢測。
[0016]所訴步驟2)和步驟3)中的報告基因檢測結(jié)果按照RLU (相對熒光強度)來表示:每孔的螢光素酶活性值用海腎螢光素酶的活性進行校正，故最后每樣品孔校正酶活性為:RLU (相對熒光強度)=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶的活性值。以空白組的RLU作為基礎(chǔ)表達(統(tǒng)計時以I表示)，其他待測物的RLU與其相比，以RLU的大小表示PXR活性的聞低。
[0017]采用本發(fā)明可以快速、方便地篩選具有調(diào)控PXR活性的化學(xué)合成物、天然藥物或食物成分。
【附圖說明】
[0018]圖1是不同濃度的陽性激動劑Rif對相對熒光強度的作用圖；圖2是不同核受體激動劑對相對熒光強度的作用圖。
具體實施方案
[0019]下面實施例是對本發(fā)明的進一步說明