一種藍蛤蛋白源ace抑制肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品加工綜合利用領(lǐng)域，具體涉及一種藍蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食物蛋白源活性肽不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)，還具有調(diào)節(jié)血壓、抗凝血、抗菌、免疫、抗氧化、降膽固醇、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、降血脂、護肝等功能。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽是一類具有抑制ACE活性的生物活性物質(zhì)，自1965年首次發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽以來，國內(nèi)外研宄人員已從不同來源的蛋白質(zhì)中制備出各種具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽類物質(zhì)。藍蛤是一種低值貝類，在黃、渤海沿海灘涂產(chǎn)量高，繁殖量大，由于其個體小、蛤肉少，目前對藍蛤精深加工較少，僅有少量用作對蝦活餌料，多數(shù)沒有被充分利用，既造成資源浪費同時給環(huán)境治理帶來了巨大壓力。藍蛤肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)資源，然而有關(guān)藍蛤蛋白源ACE抑制肽的研宄報道較少，本發(fā)明以藍蛤肉為原料開發(fā)ACE抑制肽。檢索中國專利，未見相同相似記載。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種藍蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法。
[0004]本發(fā)明所述的一種藍蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法，包括原料預(yù)處理、酶解制備和活性炭吸附，具體步驟如下:
[0005](I)原料預(yù)處理
[0006]將藍蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時后，進行真空冷凍干燥，取出藍蛤肉凍干物經(jīng)粉碎機粉碎，獲得的藍蛤肉干粉并過200-400目篩，將過篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0007](2)酶解制備
[0008]取一定量過200-400目篩的藍蛤肉干粉配制成濃度為5-10%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度30?60°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至6?11，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?6%的Protamex復(fù)合蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在6?11范圍內(nèi)(±0.05)，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解2?10小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度50?70°C，用0.1moL/L鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至5?9，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?5%的風(fēng)味蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解I?5小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，5000?9000Xg離心10分鐘，上清液為藍蛤蛋白酶解液；
[0009](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0010]在酶解液中加入占酶解液總質(zhì)量I %?5%的活性炭，攪拌2?5小時后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍蛤蛋白源ACE抑制肽粉末。
[0011]本發(fā)明所采用的ACE抑制活性的測定，具體步驟為:
[0012]取30 μ L馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)底物液，加入10 μ L抑制劑混合均勻，在370C ±0.5°C恒溫水浴中預(yù)熱3-5分鐘，然后加入20 μ L血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)液充分混合，37°C保溫30分鐘后，再加入60 μ L的lmol/LHCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。同時用10 μ LpH為8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對照組。該反應(yīng)液用0.45 μ m濾膜過濾后直接用HPLC系統(tǒng)進行分析。色譜條件:柱溫25 °C，流速0.5mL/min，流動相乙腈/水(0.05 %TFA)比例為25/75等度洗脫，檢測波長228nm.
[0013]ACE抑制活性計算公式如下:
[0014]ACE 抑制活性(% ) = 100 (M-N)/M
[0015]式中:M為空白對照組中馬尿酸的峰面積。
[0016]N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。
[0017]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)藍蛤蛋白源ACE抑制肽的制備采用分步酶解方式，由于兩種酶的底物特異性不同，第一步酶解產(chǎn)物能與第二步加入的蛋白酶充分接觸而被充分降解，因而最終獲得的活性肽分子量更低，更易于人體直接吸收進而發(fā)揮其調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的作用；同時本發(fā)明將低值貝類藍蛤進行精深加工，不僅改變了當(dāng)前藍蛤的低利用率的現(xiàn)狀，而且減輕了海洋環(huán)境治理的負(fù)擔(dān)。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步闡述，但不限于此。
[0019]實施例1:
[0020](I)原料預(yù)處理
[0021]將藍蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時后，進行真空冷凍干燥，取出藍蛤肉凍干物經(jīng)粉碎擊粉碎，獲得的藍蛤肉干粉并過200目篩，將過篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0022](2)酶解制備
[0023]取一定量過200目篩的藍蛤肉干粉配制成濃度為5%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度30°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至6，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%的Protamex復(fù)合蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在6 (±0.05)，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解2小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度50°C，用0.1moL/L鹽酸溶液調(diào)解pH至5，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%的風(fēng)味蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解2小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，5000 Xg離心10分鐘，上清液為藍蛤蛋白酶解液；
[0024](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0025]在酶解液中加入占其總質(zhì)量I %的活性炭，攪拌2小時后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，經(jīng)ACE抑制活性的測定，其對ACE活性的抑制率>40%。
[0026]實施例2:
[0027](I)原料預(yù)處理
[0028]將藍蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時后，進行真空冷凍干燥，取出藍蛤肉凍干物經(jīng)粉碎擊粉碎，獲得的藍蛤肉干粉并過300目篩，將過篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0029](2)酶解制備
[0030]取一定量過300目篩的藍蛤肉干粉配制成濃度為8%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度50°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至9，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量5%的Protamex復(fù)合蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在9 (±0.05)，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解5小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度60°C，用0.1moL/L鹽酸溶液調(diào)解pH至7，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量4%的風(fēng)味蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解5小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，9000 Xg離心10分鐘，上清液為藍蛤蛋白酶解液；
[0031](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0032]在酶解液中加入占其總質(zhì)量5%的活性炭，攪拌5小時后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，經(jīng)ACE抑制活性的測定，其對ACE活性的抑制率>50%。
[0033]實施例3:
[0034](I)原料預(yù)處理
[0035]將藍蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時后，進行真空冷凍干燥，取出藍蛤肉凍干物經(jīng)粉碎擊粉碎，獲得的藍蛤肉干粉并過400目篩，將過篩后的粉末保存用于酶解制備。
[0036](2)酶解制備
[0037]取一定量過400目篩的藍蛤肉干粉配制成濃度為10%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度60°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至11，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量6%的Protamex復(fù)合蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并不斷加入0.5moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在11 (±0.05)，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解10小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度70°C，用0.1moL/L鹽酸溶液調(diào)解pH至9，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量5%的風(fēng)味蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解10小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘，7000 Xg離心10分鐘，上清液為藍蛤蛋白酶解液:
[0038](3)活性炭吸附及冷凍干燥
[0039]在酶解液中加入占其總質(zhì)量3%的活性炭，攪拌3小時后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，經(jīng)ACE抑制活性的測定，其對ACE活性的抑制率>45%。
【主權(quán)項】
1.一種藍蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 原料預(yù)處理: 將藍蛤肉洗凈后瀝干，經(jīng)預(yù)凍3小時后，進行真空冷凍干燥，取出藍蛤肉凍干物經(jīng)粉碎機粉碎，獲得的藍蛤肉干粉過200-400目篩，將過篩后的粉末保存用于酶解制備； 酶解制備: 取一定量過200-400目篩的藍蛤肉干粉配制成濃度為5-10%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90°C熱變性10分鐘，冷卻至酶解溫度30?60°C，用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至6?11，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?6%的Protamex復(fù)合蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，并不斷加入0.1moL/L氫氧化鈉溶液以維持pH值在6?11范圍內(nèi)(±0.05)，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解2?10小時后經(jīng)100°C滅酶10分鐘；冷卻至溫度50?70°C，用0.1moL/L鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至5?9，加入占藍蛤肉蛋白質(zhì)質(zhì)量1%?5%的風(fēng)味蛋白酶進行酶解，酶解過程中不斷攪拌，酶解過程中每隔30分鐘取10毫升酶解液離心后進行ACE抑制活性的測定，酶解I?5小時后經(jīng)100°C滅酶10min，5000?9000Xg離心lOmin，上清液為藍蛤蛋白酶解液；活性炭吸附及冷凍干燥: 在酶解液中加入占其總質(zhì)量1%?5%的活性炭，攪拌2?5小時后離心去除活性炭，經(jīng)冷凍干燥得到藍蛤蛋白源ACE抑制肽粉末。
【專利摘要】本發(fā)明屬于水產(chǎn)品加工綜合利用領(lǐng)域，具體涉及一種藍蛤蛋白源ACE抑制肽的制備方法。針對目前藍蛤蛋白資源精深加工較少，造成資源浪費，本發(fā)明以藍蛤肉為原料經(jīng)原料預(yù)處理、雙酶分步酶解制備、活性炭吸附和冷凍干燥，最終獲得藍蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，其對ACE活性的抑制率大于40％。本發(fā)明提供了一種ACE抑制肽開發(fā)的潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白資源，同時解決了藍蛤未被充分利用既造成的資源浪費以及給環(huán)境治理帶來了巨大壓力的難題。
【IPC分類】C12P21-06
【公開號】CN104593462
【申請?zhí)枴緾N201410857104
【發(fā)明人】于志鵬, 趙文竹, 張宏陽, 勵建榮
【申請人】渤海大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月31日