應(yīng)用候選基因策略快速鑒定大豆抗白粉病基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是借助于大豆測序全基因組序列，利用植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信 息學(xué)和候選基因策略等方法快速鑒定大豆白粉病基因，主要涉及到大豆全基因組序列的下 載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進(jìn)而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術(shù) 科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆白粉病是一種有真菌引起的病害，是影響世界大豆生產(chǎn)的主要病害之一，也 是威脅我國大豆生產(chǎn)的一種常見病害。白粉病主要危害大豆葉片，不為害豆莢，葉柄及莖桿 極少發(fā)病。感病初期，葉上出現(xiàn)斑點(diǎn)圓形，具黑暗綠暈圈。之后逐漸長滿白色粉狀物，后期 白色粉狀物上出現(xiàn)黑褐色球狀顆粒物，最后病葉變黃脫落，嚴(yán)重影響植株生長發(fā)育。實(shí)踐證 明，防治大豆白粉病最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的方法是培育抗白粉病的品種。而大豆白粉病抗病 基因的鑒定、定位和克隆，是培育抗病品種的重要基礎(chǔ)。
[0003] ML0是植物特有的一類抗病基因，其編碼的產(chǎn)物可以直接引起抗病反應(yīng)，但到目 前為止只在大麥中發(fā)現(xiàn)存在這樣的基因，它編碼一個(gè)7次跨膜的蛋白，顯性基因的表達(dá)產(chǎn) 物可能是細(xì)胞程序化死亡和防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，當(dāng)它處于隱性時(shí)即可表現(xiàn)廣譜的抗病 性，具有極大的應(yīng)用前景。因此挖掘大豆中的ML0型抗病基因?qū)Υ蠖箍拱追鄄∮N具有重 要的意義。
[0004]ML0型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發(fā)現(xiàn)ML0(Mildew resistancelocus2)基因?qū)Π追鄄】剐允鞘加?937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集 了很多品種的大麥，其中的兩個(gè)株系對白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.hordei)所有 已知的生理小種都具有高效抗性。進(jìn)一步研究表明，大麥中ML0基因的隱性突變mlo可以 使大麥對幾乎所有已知大麥白粉病菌的生理小種產(chǎn)生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發(fā)現(xiàn) 很多植物的抗白粉病基因都是ML0型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根 等等。因此挖掘植物中的ML0型抗病基因?qū)χ参锟拱追鄄∮N具有重要的作用。
[0005]目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等方法。但是由于大 豆的基礎(chǔ)研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時(shí)間長而且很難準(zhǔn)確地克隆這些基因。因 此，如何快速鑒定大豆中的ML0型抗病基因?qū)⒊蔀榇蠖箍拱追鄄∮N的重要前提。
[0006] 植物比較基因組學(xué)（ComparativeGenomics)是基于基因組測序基礎(chǔ)上，對已知的 基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式植 物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆其他植物基因，揭示 基因功能和分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。本專利所采用的方法及思 路：模式植物擬南芥基因組研究已經(jīng)揭示了ML0型基因的功能，利用基因其順序上的同源 性克隆大豆ML0型抗病基因，根據(jù)模式植物擬南芥實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上的優(yōu)越性和已知ML0型抗病 基因的特點(diǎn)，快速"捕捉"大豆抗白粉病基因。近年來，大豆基因組測序的完成為我們快速 挖掘大豆白粉病基因提供了條件。本專利介紹了以大豆全基因組序列為前提，結(jié)合比較基 因組學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和候選基因策略等知識，快速挖掘白粉病基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種通過結(jié)合植物比較基因組學(xué)、植物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和 生物信息學(xué)等知識，快速挖掘大豆抗白粉病基因。其結(jié)果一方面可用于大豆白粉病基因緊 密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據(jù)。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 主要原理：第一個(gè)植物抗白粉病基因（ML0)是從大麥中克隆的，研究發(fā)現(xiàn)此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數(shù)NBS(nucleotide-bindingsite)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的都是ML0型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗(yàn)證實(shí)ML0 型抗病基因已經(jīng)成為植物特有的一類抗白粉病基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物ML0類型基因是一 個(gè)基因家族；而且對來源于不同物種的ML0基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類ML0基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。大豆基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經(jīng)測序的大豆全基因組中ML0基因家族和已經(jīng)克隆的ML0白粉病基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系以及對于維持白粉病基因ML0重要功能的氨基酸保守性來鑒定大豆白粉病基因。
[0011] 主要步驟如下：
[0012] 1)大豆全基因組序列的下載及其ML0型基因的采集
[0013] 首先從大豆測序基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.phytozome.net/search.php)下載 大豆全基因組序列；使用"DNAT00LS"軟件對獲得的大豆全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)建立數(shù) 據(jù)庫，然后用pfam數(shù)據(jù)庫（蛋白家族數(shù)據(jù)庫，http://pfamjanelia.org/search/sequence) 中的隱馬爾可夫模型（HMM)對ML0結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已建立的大豆全基因組氨基酸序 列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp(E-value= 0. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。其次，利用 已經(jīng)公布的ML0型基因序列，對大豆基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，獲得候選基因序列。
[0014] 2)大豆ML0型基因家族的鑒定
[0015] 將上述結(jié)果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pfam(E-valUe= 1.0)進(jìn) 行分析，去除無'ML0'結(jié)構(gòu)域的基因序列（圖1)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. 1軟 件提供的ClustalW工具（多序列比對程序）進(jìn)行多序列比對，去除重復(fù)序列。
[0016] 3)通過植物ML0型基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鑒定候選的大豆ML0型白粉病基因
[0017] 由于先前的研究已經(jīng)證明，雙子葉植物ML0型白粉病基因位于植物ML0基因系統(tǒng) 發(fā)育樹同一區(qū)組，因此在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中，我們把擬南芥的ML0型基因家族和一些其 他作物的ML0型抗白粉病基因和大豆ML0型基因一起聚類分析，以獲得候選的大豆抗白粉 病基因（圖2)。
[0018] 4)大豆白粉病基因與已知的植物ML0白粉病基因的比對
[0019] 利用BioXM2. 6軟件將大豆候選的ML0型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的 ML0白粉病基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成Fasta格式的文件，將這些文件導(dǎo)入Bi〇Edit7. 0軟件， 運(yùn)用此軟件中Clustal軟件進(jìn)行多序列比對，揭示候選白粉病基因重要氨基酸殘基及區(qū)域 的保守性。從而進(jìn)一步鑒定大豆候選的白粉病基因（圖3)。
[0020] 本發(fā)明的積極效果：
[0021] 1)縮短了大豆白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規(guī)方 法（圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時(shí)耗力、效率低，且難以成功。本 發(fā)明基于植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)方法快速挖掘大豆白粉病基因，不僅可以 縮短時(shí)間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0022] 2)大豆（Glycinemax)屬于蝶形花科大豆屬，是全世界廣泛種植的重要作物之 一。由于大豆遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源多樣性低，因此通過常規(guī)的分子標(biāo)記（RAPD、ISSR、 SSR、AFLP等）鑒定大豆白粉病基因比較困難。通過鑒定的候選白粉病基因開發(fā)相應(yīng)的共 分離功能性標(biāo)記（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子標(biāo)記輔助選擇，，進(jìn)行多 抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種年限，提高育種效率。
[0023] 3)為闡述大豆抗白粉病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。大豆抗白粉病基因的鑒定，通過轉(zhuǎn) 基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS)技術(shù)等研究 抗白粉病的分子機(jī)制提供了基因資源，有利于快速闡述大豆抗白粉病的作用機(jī)理。
【附圖說明】
[0024] 圖1大iiML0基因的鑒定；
[0025] 本圖顯示的是24個(gè)ML0型基因鑒定結(jié)果，每一個(gè)基因都含有一個(gè)'ML0'保守結(jié)構(gòu) 域。
[0026] 圖2植物ML0基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析及其大豆ML0型白粉病基因的鑒定；
[0027] 擬南芥是植物科學(xué)研究的模式植物，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中，擬南芥的15個(gè)ML0型 基因（其中3個(gè)基因是白粉病基因：AtML002,AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (S1ML0)、大麥白粉病基因（HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被選擇用來和 大豆ML0型基因聚類分析。共鑒定出1個(gè)大豆候選的ML0型白粉病基因。圖中斜體標(biāo)記的 基因就是候選大豆白粉病基因。
[0028] 圖3大豆ML0型白粉病基因的比對分析；
[0029] 1個(gè)大豆白粉病基因與大麥（HvMLO)、番茄（S1ML0)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病 基因（AtML002,AtML006和AtML012)進(jìn)行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基 和區(qū)域的保守型。圖中TM1-TM7表示大豆ML0型白粉病基因的7個(gè)轉(zhuǎn)模區(qū)域；黑色圓點(diǎn)表 示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)；I和II表示對白粉菌侵染 重要的氨基酸區(qū)域。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出大豆白粉病基因。具體實(shí)施過程如下：
[0031] 1)大豆ML0型基因的采集
[0032] 為了獲得大豆全部的ML0型基因家族成員，我們首先以擬南芥的ML0型基因，番 茄、豌豆、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病ML0基因序列構(gòu)建HMM模型，從大豆基因組序列中 收索MLO型基因；其次以不同作物中已經(jīng)發(fā)表的MLO基因序列作為靶序列（來自DFCI數(shù) 據(jù)庫：TC171015,TC267529,DFCI:TC327983,TC289653,TC312087,TC132500,TC133436， TC317623,TC317025,TC315947,TC325903,TC315944,TC315912,TC322759,TC322059, TC330654,TC282713,TC293173,TC281861,TC283253,TC283383,TC285032,TC290021, TC302716,TC283487,TC282866,TC283441，TC281428,TC285118,TC285090 ;來自GenBank數(shù) 據(jù)庫：AY967408,AF384145,AF384144,AY029312-AY029315,AY029317-AY029319,Z95352， AF369563-AF369565,AF369567,AF369569-AF369