Y染色體中特異性甲基化位點(diǎn)作為癌癥診斷標(biāo)志物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為癌癥診斷標(biāo)志物的Y染色體中特異甲基化位點(diǎn)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA甲基化是一種常見(jiàn)的表觀遺傳(epigenetic)修飾，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，利用S—腺苷甲硫氨酸提供的甲基，將胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，從而使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5 —甲基胞嘧啶，其對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控有著至關(guān)重要的作用。
[0003]癌癥，又被稱為惡性腫瘤，是由控制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖機(jī)制的失常而引起的疾病。正常情況下，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖由包括癌基因和抑癌基因在內(nèi)的一些調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的基因嚴(yán)密調(diào)控，保持正常的生理狀態(tài)；在受到輻射，化學(xué)污染，病毒感染以及內(nèi)分泌失衡等多種因素的影響下，導(dǎo)致體內(nèi)癌基因的激活以及抑癌基因的失活，從而導(dǎo)致的癌癥的發(fā)生。除了基因突變之外，表觀遺傳如組蛋白修飾、DNA甲基化等異常調(diào)節(jié)也在腫瘤的發(fā)生發(fā)發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。在多種癌癥中均有發(fā)現(xiàn)表觀修飾的異常?？傊?，腫瘤的發(fā)生時(shí)一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，是由于體內(nèi)癌基因、抑癌基因以及表觀修飾等異常調(diào)節(jié)并積累的結(jié)果。
[0004]DNA甲基化與癌癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系，在許多癌癥中都發(fā)現(xiàn)存在DNA甲基化異常的現(xiàn)象。DNA甲基化具有一定的穩(wěn)定性，它是癌癥發(fā)生中的早期事件。近年來(lái)許多研宄證明，DNA的甲基化異?？梢宰鳛橐环N癌癥診斷的生物標(biāo)志物。目前，許多特定基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化異常被用來(lái)作為前列腺癌診斷的一種潛在標(biāo)志物。
[0005]目前前列腺癌的主要診斷方法是直腸診斷、血清PSA、組織免疫切片等，其中組織免疫切片是前列腺癌的黃金診斷方法，但是由于其要首先獲得病人的前列腺組織，給病人帶來(lái)較大的痛苦，不太適合前期診斷。PSA是目前用于前列腺癌前期診斷的一種標(biāo)志物，但是其檢測(cè)并不是十分精確，存在一定的灰區(qū)。所以尋找一種方便準(zhǔn)確的診斷標(biāo)志物對(duì)于前列腺癌的早期診斷十分迫切。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中，存在各種針對(duì)DNA甲基化監(jiān)測(cè)的方法，比如CN104062334A所公開(kāi)的一種針對(duì)DNA甲基化監(jiān)測(cè)的定量分析方法，再比如DNA甲基化芯片技術(shù)。但是，現(xiàn)階段在檢測(cè)甲基化是否異常時(shí)缺乏一個(gè)統(tǒng)一的、較為準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法通過(guò)特定位點(diǎn)甲基化水平的變化以盡早預(yù)測(cè)患有癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種癌癥早期診斷的方法。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種利用檢測(cè)Y染色體特定甲基化位點(diǎn)甲基化水平的變化情況來(lái)輔助診斷癌癥的方法。
[0009]本發(fā)明人通過(guò)癌旁間以及癌旁和癌間分別對(duì)比，找出了特定的甲基化位點(diǎn)，即在癌旁中個(gè)體間差異很小而在癌中具有明顯差異的甲基化位點(diǎn)，并以該位點(diǎn)在癌旁中的平均甲基化水平作為驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比待檢測(cè)病人的該位點(diǎn)甲基化水平，觀察是否發(fā)生異常，來(lái)判斷病人是否具有患有前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0010]具體地，首先從癌旁樣本中篩選出相對(duì)保守的甲基化位點(diǎn)；然后再根據(jù)癌組織和癌旁組織進(jìn)行對(duì)比，找出具有明顯差異的位點(diǎn)；最后篩選出具有明顯差異的保守性甲基化位點(diǎn)，即可作為潛在的診斷標(biāo)志物。
[0011]所述保守性甲基化位點(diǎn)為癌旁樣本間SD值小于等于0.25的點(diǎn)；所述明顯差異為癌組織和癌旁組織甲基化水平差值的絕對(duì)值大于等于0.2，P值小于等于0.01。
[0012]因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種Y染色體特異性甲基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的甲基化水平的突變可以作為前列腺癌診斷的新的靶點(diǎn)。
[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種Y染色體特異性甲基化位點(diǎn)的篩選方法，所述方法包括:a)獲取患者樣本，b)從a)步驟獲得的樣本提取DNA，c)確定樣本的全基因組甲基化水平，d)分析Y染色體甲基化信息，e)篩選甲基化保守位點(diǎn)，f)篩選具有明顯差異的甲基化位點(diǎn)，g)篩選具有明顯差異的甲基化保守位點(diǎn)。
[0014]優(yōu)選地，所述樣本為癌組織和癌旁組織。所述癌組織優(yōu)選為前列腺癌組織。
[0015]優(yōu)選地，所述甲基化保守位點(diǎn)為在癌旁組織中樣本間標(biāo)準(zhǔn)方差SD值小于等于
0.25的點(diǎn)。
[0016]優(yōu)選地，所述明顯差異為甲基化水平變化在0.2及以上，且P值和q值均小于等于
0.0lo可選地，所述變化為升高或降低。
[0017]優(yōu)選地，所述具有明顯差異的甲基化保守位點(diǎn)為癌旁樣本間標(biāo)準(zhǔn)方差SD值在
0.25以內(nèi)且在癌組織中甲基化水平升高或降低了 0.2及以上水平的點(diǎn)。
[0018]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種癌癥診斷標(biāo)志物，所述標(biāo)志物由Y染色體中特異性甲基化位點(diǎn)組成，所述位點(diǎn)通過(guò)上述方法篩選得到。
[0019]具體地，所述癌癥診斷標(biāo)志物包括cg03052502、cg04462340、cg05163709、cg05544622、cgl4466580 和 cg27539893。
[0020]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種癌癥診斷標(biāo)志物在制備癌癥早期診斷的試劑中的用途。優(yōu)選地，所述癌癥為前列腺癌。
[0021]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種癌癥診斷標(biāo)志物在制備預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑中的用途。優(yōu)選地，所述癌癥為前列腺癌。
[0022]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種早期診斷癌癥的試劑盒。優(yōu)選地，所述癌癥為前列腺癌。
[0023]有益效果:
[0024]本發(fā)明提供了一種有效篩選癌癥診斷標(biāo)志物的方法，并提供了較為準(zhǔn)確的篩選標(biāo)準(zhǔn)，拓展了癌癥臨床檢測(cè)的途徑，所篩選出的特異性位點(diǎn)可以有效用于癌癥的早期快速診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為癌旁組織中篩選出的75個(gè)保守位點(diǎn)的甲基化水平熱圖。
[0026]圖2為癌組織和癌旁組織對(duì)比篩選出的37個(gè)具有明顯變化的甲基化位點(diǎn)。
[0027]圖3為在75個(gè)癌旁組織中保守的位點(diǎn)，6個(gè)在癌組織中發(fā)生了明顯的變化。
[0028]圖4為篩選出的最終的6個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平(上圖)，以及每個(gè)位點(diǎn)在66例癌組織中發(fā)生明顯變化的比例(下圖，黑色標(biāo)記代表明顯變化)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下實(shí)施例用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，其并不用于限制本發(fā)明。
[0030]實(shí)施例1癌組織及癌旁組織的收集鑒定
[0031]從病人癌癥切割手術(shù)中搜集組織，并經(jīng)具有豐富經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師通過(guò)組織免疫切片將癌組織和癌旁組織區(qū)分對(duì)應(yīng)收集。
[0032]實(shí)施例2保守甲基化位點(diǎn)的篩選
[0033]搜集獲取66例前列腺癌病人的癌旁組織，并從中提取DNA。利用DNA甲基化芯片測(cè)得66例樣本的全基因組甲基化水平，分取其中Y染色體甲基化信息分析對(duì)比，根據(jù)樣本間的SD值篩選出甲基化保守位點(diǎn)(SD值< 0.25)。結(jié)果參見(jiàn)圖1。
[0034]實(shí)施例3明顯差異的甲基化位點(diǎn)的篩選
[0035]利用Illumina Methylat1n Analyzer (IMA)軟件包，根據(jù)66對(duì)癌組織和癌旁組織間的Y染色體上DNA甲基化水平比對(duì)，篩選出在癌組織中具有明顯變化的DNA甲基化位點(diǎn)(甲基化水平變化β彡0.2，P值彡0.01)。
[0036]實(shí)施例4篩選出發(fā)生明顯變化的保守性位點(diǎn)
[0037]根據(jù)實(shí)施例2和實(shí)施例3中的結(jié)果，篩選出兩者的交集(即在癌旁組織中保守而在癌組織中發(fā)生明顯變化的甲基化位點(diǎn))，共6個(gè)位點(diǎn)(見(jiàn)圖3)，并且將這6個(gè)位點(diǎn)在每一對(duì)癌-癌旁中對(duì)比檢測(cè)，計(jì)算出有多少比例的癌中確實(shí)發(fā)生了明顯的甲基化變化(見(jiàn)圖4)。這些交集位點(diǎn)即在癌中發(fā)生明顯甲基化水平變化的保守位點(diǎn)，可以作為前列腺癌診斷的標(biāo)志物。
[0038]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種癌癥早期診斷的方法，其特征在于，利用檢測(cè)Y染色體特定甲基化位點(diǎn)甲基化水平的變化情況來(lái)輔助診斷癌癥的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 從癌旁樣本中篩選出相對(duì)保守的甲基化位點(diǎn)，根據(jù)癌組織和癌旁組織進(jìn)行對(duì)比，找出具有明顯差異的位點(diǎn)，篩選出具有明顯差異的保守性甲基化位點(diǎn)作為診斷標(biāo)志物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述保守性甲基化位點(diǎn)為癌旁樣本間SD值小于等于0.25的點(diǎn)；所述明顯差異為癌組織和癌旁組織甲基化水平差值的絕對(duì)值大于等于0.2，P值小于等于0.01。
4.一種Y染色體特異性甲基化位點(diǎn)，其特征在于，該位點(diǎn)的甲基化水平的突變可以作為前列腺癌診斷的靶點(diǎn)；優(yōu)選地，所述位點(diǎn)包括cg03052502、cg04462340、cg05163709、cg05544622、cgl4466580 和 cg27539893。
5.—種Y染色體特異性甲基化位點(diǎn)的篩選方法，所述方法包括:a)獲取患者樣本，b)從a)步驟獲得的樣本提取DNA，c)確定樣本的全基因組甲基化水平，d)分析Y染色體甲基化信息，e)篩選甲基化保守位點(diǎn)，f)篩選具有明顯差異的甲基化位點(diǎn)，g)篩選具有明顯差異的甲基化保守位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述樣本為癌組織和癌旁組織，所述癌組織優(yōu)選為前列腺癌組織。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述甲基化保守位點(diǎn)為在癌旁組織中樣本間標(biāo)準(zhǔn)方差SD值小于等于0.25的點(diǎn)，所述明顯差異為甲基化水平變化在0.2及以上，且P值和q值均小于等于0.01 ;可選地，所述變化為升高或降低。
8.—種癌癥診斷標(biāo)志物，所述標(biāo)志物由Y染色體中特異性甲基化位點(diǎn)組成，所述位點(diǎn)通過(guò)權(quán)利要求5 - 7任一項(xiàng)的方法篩選得到。
9.權(quán)利要求8的癌癥診斷標(biāo)志物，其中所述癌癥診斷標(biāo)志物包括cg03052502、cg04462340、cg05163709、cg05544622、cgl4466580 和 cg27539893。
10.一種癌癥診斷標(biāo)志物在制備癌癥早期診斷或預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑中的用途或是一種早期診斷癌癥的試劑盒，優(yōu)選地，所述癌癥為前列腺癌。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種癌癥早期診斷的方法，具體涉及一種Y染色體特異性甲基化位點(diǎn)的篩選方法，所述方法包括：a)獲取患者樣本，b)從a)步驟獲得的樣本提取DNA，c)確定樣本的全基因組甲基化水平，d)分析Y染色體甲基化信息，e)篩選甲基化保守位點(diǎn)，f)篩選具有明顯差異的甲基化位點(diǎn)，g)篩選具有明顯差異的甲基化保守位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及通過(guò)上述篩選方法獲得的癌癥診斷標(biāo)志物，以及其在制備癌癥早期診斷、預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的試劑或試劑盒中的用途，優(yōu)選地，上述癌癥為前列腺癌。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104593500
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510027708
【發(fā)明人】孫英麗, 姚魯帥
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月20日