一種卵巢反應(yīng)相關(guān)基因的基因檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種卵巢反應(yīng)相關(guān)基因檢測方法，可用于評估卵巢反應(yīng)相關(guān)基因檢 測，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 不孕不育是一個世界性的醫(yī)學(xué)問題和社會問題，不育夫婦占已婚育齡夫婦的 109^15%。導(dǎo)致女性不孕的原因很多，環(huán)境因素和生活方式對女性不孕癥的發(fā)生具有顯著的 影響，遺傳因素引起的不孕不育也不在少數(shù)，染色體異?；蚧蛉毕菘梢砸鹋圆辉?。這 些異?；蛉毕荩òㄈ旧w疾病、單基因疾病、多基因疾病等）可由親代傳給子代，或是由 子代生殖細(xì)胞突變形成，均可導(dǎo)致不良妊娠或不孕。
[0003]近年來，對于女性不孕遺傳因子的研究發(fā)現(xiàn)了人類基因組上的多個與女性不孕相 關(guān)的基因，其中包括町冊1?，116，1110,41?，？5冊，11^712，？?41?和1嚦-3,651]\11等。如谷胱 甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST)幾乎廣泛存在于人體所有的細(xì)胞和 組織，尤其在生殖腺、肝臟、結(jié)腸中表達(dá)較高，該基因的缺失可導(dǎo)致人體對環(huán)境中毒性物質(zhì) 的解毒能力下降，可能會影響生殖細(xì)胞的質(zhì)量，從而引起不孕。IL-10可關(guān)閉IL-UIL-6、 IL-8和腫瘤壞死因子a等細(xì)胞因子合成的啟動，抑制Thl細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，防止 對滋養(yǎng)細(xì)胞和胎兒的繼發(fā)損傷，基因變異可使IL-10表達(dá)下降,細(xì)胞免疫增強，滋養(yǎng)細(xì)胞植 入異常，胎盤淺著床，影響胚胎發(fā)育，損害妊娠，導(dǎo)致早期自然流產(chǎn)。FSHR基因的多態(tài)性可引 起FSHR空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響FSHR與其配體相互作用的過程，引起相關(guān)受體信息傳 遞的變化，影響卵巢對FSH刺激的反應(yīng)。
[0004] 由于遺傳體質(zhì)的不同，不同機(jī)體的卵巢反應(yīng)也有所差異，而這種差異會影響到機(jī) 體不孕癥的易感性。我們挑選了在中國大規(guī)模人群中得到驗證的與女性卵巢反應(yīng)相關(guān)的位 點進(jìn)行分型檢測，并結(jié)合中國人群中特有的與卵巢反應(yīng)相關(guān)的環(huán)境暴露因素和生活方式影 響因素對女性的不孕發(fā)病風(fēng)險進(jìn)行預(yù)測評估。通過基因檢測了解女性不孕與卵巢反應(yīng)相關(guān) 的遺傳因素，進(jìn)而給出相應(yīng)的營養(yǎng)和生活方式干預(yù)指導(dǎo)，提高孕育機(jī)會，孕育健康寶貝。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因與中國女性卵巢反應(yīng)有關(guān)。
[0006]基因簡介：FSHR (Follicle-stimulating hormone receptor)全稱卵泡刺激素受： 體。人FSHR基因位于2p21?pl6區(qū)，有54kbp的核間距，可以編碼695個氨基酸殘基。該 基因鏈中包含了10個外顯子和9個內(nèi)含子，每個外顯子和內(nèi)含子間均為典型的邊界序列， mRNA剪接修飾后全部留在外顯子上?，F(xiàn)已知其屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族中的糖蛋白亞 家族成員。FSHR分子由細(xì)胞外域、內(nèi)域及跨膜域3部分構(gòu)成，其中跨膜域是由7個親脂性 片段構(gòu)成的跨膜螺旋組成。螺旋由交替的細(xì)胞外環(huán)和內(nèi)環(huán)相連接，其中第一、二細(xì)胞外環(huán)有 2個高度保守的Cys殘基形成分子內(nèi)二硫鍵，可以限制蛋白的構(gòu)象，第四個內(nèi)環(huán)則與受體耦 聯(lián)及信號傳導(dǎo)有關(guān)。
[0007]FSHR是人類重要的生殖激素，通過卵泡刺激素受體，介導(dǎo)其生理功能。早期對 FSHR基因的研究多集中在基因突變上，但在自然界中基因突變的發(fā)生率極低。而FSHR基 因多態(tài)性在人群中的分布較廣，可能影響受體活性，引起卵巢功能差異，并與輔助生殖技術(shù)(ART)中的卵巢刺激反應(yīng)有一定聯(lián)系。其生理作用主要為：①直接促進(jìn)卵泡的生長、發(fā)育 和成熟。②和促黃體生成激素共同作用使卵泡分泌雌激素。③促進(jìn)精原細(xì)胞的增生以及正 常精子的產(chǎn)生。
[0008] 位點簡介：FSHRSer680Asn是位于第10外顯子上的一個G/A多態(tài)，細(xì)胞內(nèi)域的 680位密碼子，當(dāng)堿基A代替G(AGT-AAT)時，絲氨酸（Ser)變成天門冬氨酸（Asn)，對應(yīng) 的SNP為G2039A。在亞洲人群中，該多態(tài)性分布頻率A占68. 9% ;G占28. 4%。
[0009]FSHR基因羧基末端含有大量Ser和Thr殘基，認(rèn)為是發(fā)生磷酸化反應(yīng)的潛在底 物。理論上，羧基末端氨基酸的改變會降低受體的結(jié)合力并且減弱其信號的傳遞，從而降低 FSHR生物學(xué)活性，導(dǎo)致血清高FSH值。Ser或Asn構(gòu)成FSHR基因680位密碼子，Ser殘基 可以發(fā)生磷酸化影響受體翻轉(zhuǎn)，Asn殘基可引出發(fā)生糖基化的保守序列，這可能對受體蛋白 的翻譯后加工及表達(dá)于細(xì)胞表面起重要作用。FSHR基因680位的兩個基因亞型的親和力不 同，可以導(dǎo)致受體不同的生物學(xué)活性，影響激素與靶細(xì)胞的功能。
[0010] 大量研究發(fā)現(xiàn)，在IVF促排卵過程中，具有SS680基因型的受體易產(chǎn)生卵巢低反 應(yīng)，對FSH的作用可能存在一定程度的"抵抗"或敏感度下降，導(dǎo)致FSH與靶細(xì)胞作用的閾 值升高，需要更多的促性腺激素才能達(dá)到同樣的效果。
[0011] 由于？511在卵子成熟過程中的重要作用，？511受體$511代(3印如1'^5服）作為？511 在體內(nèi)發(fā)揮作用的最主要的途徑，已經(jīng)越來越受到關(guān)注。FSHR基因的多態(tài)性可引起FSHR 空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響FSHR與其配體相互作用的過程，引起相關(guān)受體信息傳遞的變 化，影響卵巢對FSH刺激的反應(yīng)，研究認(rèn)為，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性與卵巢對FSH的反應(yīng)性關(guān)系密 切。
[0012] 本發(fā)明的目的是提供一種卵巢反應(yīng)相關(guān)基因檢測方法，用以對中國女性人群中不 孕易感個體進(jìn)行篩查，在給出個體不育發(fā)病風(fēng)險的基礎(chǔ)上，為廣大的中國女性提供對不孕 遺傳易感性早知道、早預(yù)防、早治療的契機(jī)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是提供一種卵巢反應(yīng)相關(guān)基因檢測方法，并結(jié)合中國人群中特有的 與卵巢反應(yīng)相關(guān)的環(huán)境暴露因素和生活方式影響因素對女性的不孕發(fā)病風(fēng)險進(jìn)行預(yù)測評 估。
[0014] 為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供一種卵巢反應(yīng)相關(guān)基因檢測方法。其具體步驟為： 步驟1:檢測的樣品類型與采樣方法 用采樣拭在口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的 細(xì)胞樣本； 步驟2 :基因組DNA的抽提方法 采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一 2. 5小 時，經(jīng)電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢測； 步驟3 :熒光定量PCR反應(yīng) 將每一個被測者樣本分別放入反應(yīng)孔，即卵泡刺激素受體（FSHR)rs6166,另外根據(jù)實 驗需要增設(shè)不含DNA模版的NTC空白對照孔； 每一個反應(yīng)孔的基因分型可以根據(jù)下表的引物和探針設(shè)計，采用TaqMan?_MGB技術(shù)， 進(jìn)行檢測試劑合成； 在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，總體積為10M1,即濃度為20ng/ W的DNA模板2W、1W 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mM d NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0. 5W 25mM MgCl2溶液、0. 02W (5units/W)Taq DNA聚合酶、去離子水4. 98W、3個位點分別采用不同的正向引物（20剛，0. 225W)、反向引 物（20剛，0. 225W)、VIC熒光探針（10剛，0. 25W)和FAM熒光探針（10剛，0. 25W)工具進(jìn)行 檢測，基因序列及其引物探針如下： 卵泡刺激素受體（FSHR)rs6166
【主權(quán)項】
1.步驟1:檢測的樣品類型與采樣方法 用采樣拭在口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證采集到足量的 細(xì)胞樣本； 步驟2 :基因組DNA的抽提方法 采用硅膠吸附法抽提每一個口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一 2. 5小 時，經(jīng)電泳檢測后，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢測； 步驟3 :熒光定量PCR反應(yīng) 將每一個被測者樣本分別放入反應(yīng)孔，即卵泡刺激素受體（FSHR) rs6166,另外根據(jù)實 驗需要增設(shè)不含DNA模版的NTC空白對照孔； 每一個反應(yīng)孔的基因分型可以根據(jù)下表的引物和探針設(shè)計，采用TaqMan?_MGB技術(shù)， 進(jìn)行檢測試劑合成； 在每一個反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，總體積為10M1,即濃度為20ng/ W的DNA模板2W、1W 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液ABI Taqman ? MGB、0.1W 25mM d NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0. 5W 25mM MgCl2溶液、0. 02W (5units/W)Taq DNA聚合酶、去離子水4. 98W、3個位點分別采用不同的正向引物（20剛，0. 225W)、反向引 物（20剛，0. 225W)、VIC熒光探針（10剛，0. 25W)和FAM熒光探針（10剛，0. 25W)工具進(jìn)行 檢測，基因序列及其引物探針如下： 卵泡刺激素受體（FSHR) rs6166 ggtgagcatc tgcctgccca tggatattga cagccctttg tcacagctgt atgtcatgtc cctccttgtg ctcaatgtcc tggcctttgt ggtcatctgt ggctgctata tccacatcta cctcacagtg cggaacccca acatcgtgtc ctcctctagt gacaccagga tcgccaagcg catggccatg ctcatcttca ctgacttcct ctgcatggca cccatttctt tctttgccat ttctgcctcc ctcaaggtgc ccctcatcac tgtgtccaaa gcaaagattc tgctggttct gtttcacccc atcaactcct gtgccaaccc cttcctctat gccatcttta ccaaaaactt tcgcagagat ttcttcattc tgctgagcaa gtgtggctgc tatgaaatgc aagcccaaat ttataggaca gaaacttcat ccactgtcca caacacccat ccaaggaatg gccactgctc ttcagctccc agagtcacca ntggttccac ttacatactt gtccctctaa gtcatttagc ccaaaactaa aacacaatgt gaaaatgtat ctgagtattg aatgataatt cagtcttgcc tttgaagggt atgtcacaaa agctgacagt gcttctacac atttcatcta atttaatatt cctggcatac ctttaaggta aattggtcag gaactattaa ttccatgtga tacattagga agctgaatta ttagtaacaa caataataat taaagaatgc aatactgtat tacatatttt atccttatat atgttatttt tgcacgttat gttcaaagtg cttttgttca gatatctcaa gtgatccctg ttaaataagc aggacaggga ttattcttgg agttttacaa atgaggaaac cacgactcaa agagttaagt gacttgttca aaattgttta gtttgtaaga ggcagagcca ggattaggta ttccgactcc cagagaattt cccagagaag 帶VIC熒光A型探針CCAaTGGITCCAC帶FAM熒光G型探針CCAgTGGTTCCAC 正向引物 TGGCTGCTATGAAATGCAAG 反向引物 CCCTTCAAAGGCAAGACTGA 將反應(yīng)孔和空白對照在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，先進(jìn)行預(yù)熱：50°C、2分鐘，95°C、10分 鐘，然后再進(jìn)行60個循環(huán)的95°C、30秒,60°C、1分鐘、反應(yīng)結(jié)束后取出后再放入熒光定量 PCR儀上讀取樣品熒光量，得到卵泡刺激素受體（FSHR) rs6166圖片； 步驟4 :SNP基因型分析 將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的圖和一個NTC空白對照進(jìn)行比較，每 個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM 熒光信號，分別代表該位點三種不同的基因型； (1)、卵泡刺激素受體（FSHR) rs6166 在檢測結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域為空白對照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域為AA基因型、坐標(biāo)軸 右上區(qū)域為AG基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域為GG基因型。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種卵巢反應(yīng)相關(guān)基因檢測方法，其特征在于，通過檢測分析個體的FSHR基因SNPs位點基因攜帶型為所有的受檢者提供卵巢反應(yīng)相關(guān)基因檢測，用以對中國女性人群中不孕易感個體進(jìn)行篩查，在給出個體不育發(fā)病風(fēng)險的基礎(chǔ)上，為廣大的中國女性提供對不孕遺傳易感性早知道、早預(yù)防、早治療的契機(jī)。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104593513
【申請?zhí)枴緾N201510061380
【發(fā)明人】傅詠南, 王校, 張奕
【申請人】上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年2月6日