能夠產(chǎn)生腺伴隨病毒載體的細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及在基因療法的研宄或臨床領(lǐng)域中特別用于將基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入人體中的 能夠產(chǎn)生具有高滴度的腺伴隨病毒載體的細(xì)胞。
[0002] 發(fā)明背景 目前，為了治療癌癥或感染以及治療先天性遺傳疾病，進(jìn)行了使用病毒載體的基因療 法的許多嘗試。在許多情況下，作為病毒載體，按慣例使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺病毒載體。
[0003] 腺伴隨病毒（AAV)是線性單鏈DNA病毒，可感染大范圍物種（包括人）的細(xì)胞。 AAV還感染其中分化終止的不發(fā)生細(xì)胞分裂的細(xì)胞，包括血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。另 夕卜，因?yàn)锳AV對(duì)人類(lèi)不是致病性的，所以具有低的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且AAV的病毒顆粒是 穩(wěn)定的。出于這些原因，近來(lái)開(kāi)發(fā)用于基因轉(zhuǎn)移的AAV載體在繼續(xù)進(jìn)行之中。
[0004] 為了產(chǎn)生用于基因轉(zhuǎn)移的AAV載體，正如其它病毒載體一樣，在形成病毒顆粒所 需要的存在于野生型AAV基因組的元件中，將需要以順式提供的元件和可以反式提供的元 件分別導(dǎo)入用于病毒產(chǎn)生的細(xì)胞中和使它們?cè)诩?xì)胞中表達(dá)，因此防止在被AAV載體感染的 宿主中野生型AAV的產(chǎn)生和AAV載體的自我復(fù)制（專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
[0005] 用于產(chǎn)生AAV載體的已確立的常規(guī)方法包括：1)將其中保留置于野生型AAV基因 組各端的ITR并剔除rep和cap基因的AAV載體質(zhì)粒導(dǎo)入，2)導(dǎo)入用于表達(dá)rep和cap基 因的質(zhì)粒以便以反式提供Rep和Cap蛋白，并且，因?yàn)锳AV需要提供來(lái)自所謂輔助病毒（例 如腺病毒、皰瘆病毒或痘苗病毒）的補(bǔ)充元件用于形成感染性病毒顆粒，所以3)用腺病毒 感染（專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。
[0006] 然而，通過(guò)上述方法獲得的AAV載體從理論上說(shuō)被腺病毒污染。腺病毒污染物必 須排除或滅活，這是造成AAV載體滴度降低的原因。另外，對(duì)將被腺病毒污染的AAV載體給 予人可能引起副作用（例如腺病毒感染或炎癥）存有擔(dān)憂。因此，開(kāi)發(fā)了一種用于產(chǎn)生AAV 載體的方法，其包括：用以替代上述步驟3)的步驟3'）導(dǎo)入在腺病毒來(lái)源的元件中只表達(dá) 形成AAV病毒顆粒所必需的元件的輔助質(zhì)粒（無(wú)輔助病毒系統(tǒng)（Helper-free system)) (專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。按照所述方法產(chǎn)生的AAV載體不被腺病毒污染，因此是極安全的。
[0007] 另一方面，對(duì)于預(yù)期用于基因療法的研宄或臨床領(lǐng)域的AAV載體的產(chǎn)生，必須獲 得具有高滴度的病毒載體溶液。為此，根據(jù)來(lái)源于人的HeLa細(xì)胞或A549細(xì)胞產(chǎn)生恒定表 達(dá)rep和cap基因的細(xì)胞系，并進(jìn)行了控制這些基因的表達(dá)水平的嘗試。然而，由此獲得的 AAV載體沒(méi)有足夠的滴度。因此，需要用于產(chǎn)生具有較高滴度的AAV載體的方法。
[0008] 引用文獻(xiàn)列表 專(zhuān)利文獻(xiàn) 專(zhuān)利文獻(xiàn)I :USP6093570 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :W097/06272 專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 :W097/17458。
[0009] 發(fā)明概述 本發(fā)明要解決的問(wèn)題 本發(fā)明的目的是提供在沒(méi)有復(fù)雜操作的情況下獲得具有高滴度的AAV載體溶液的細(xì) 胞和包括使用所述細(xì)胞產(chǎn)生AAV載體的方法和試劑盒。
[0010] 解決問(wèn)題的技術(shù)方案 如上所述，對(duì)于預(yù)期用于基因療法的研宄或臨床領(lǐng)域的AAV載體的產(chǎn)生，需要能夠產(chǎn) 生具有較高滴度的AAV載體的方法。本發(fā)明人潛心研宄并最終發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)生AAV載體時(shí)，通 過(guò)使用表達(dá)人工導(dǎo)入的miRNA (例如hsa-miR_196al、hsa-miR-324或hsa-miR-342)的細(xì) 胞，獲得具有高于通過(guò)常規(guī)方法獲得的載體的滴度的AAV載體。因此，完成了本發(fā)明。
[0011] 本發(fā)明概述如下。本發(fā)明涉及：
[1] 一種能夠產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞，其中表達(dá)人工導(dǎo)入的miRNA，
[2] [1]的細(xì)胞，其中人工導(dǎo)入的miRNA是選自hsa-miR-196al、hsa-miR-324和 hsa-miR-342 的至少一種，
[3] -種產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞，其是導(dǎo)入了待包封入病毒中的核酸的[1]或[2]的細(xì) 胞，
[4] 一種用于產(chǎn)生AAV載體的方法，所述方法包括培養(yǎng)[3]的細(xì)胞的步驟，
[5] -種用于產(chǎn)生AAV載體的試劑盒，其包含用于提供miRNA的核酸和用于提供形成 AVV載體的病毒顆粒所必需的元件的核酸，
[6] -種通過(guò)[4]的方法可獲得的AAV載體，
[7] -種通過(guò)在產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞中表達(dá)miRNA來(lái)選擇可引起產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞 產(chǎn)生AAV載體的能力提高的miRNA的方法，所述方法包括制備表達(dá)miRNA的AAV載體的混 合物的步驟和選擇在細(xì)胞中大量產(chǎn)生的AAV載體的步驟，和
[8] [7]的方法，所述方法包括下列（a)-(e)的步驟： (a) 獲得表達(dá)miRNA的AAV載體的混合物的步驟； (b) 用表達(dá)miRNA的AAV載體的混合物感染細(xì)胞的步驟； (c) 培養(yǎng)通過(guò)步驟（b)獲得的細(xì)胞以獲得由細(xì)胞產(chǎn)生的AAV載體混合物的步驟； (d) 使用通過(guò)步驟（c)獲得的AAV載體混合物重復(fù)步驟（b)和（c) 一次或多次的步驟； 和 (e) 獲得編碼在通過(guò)步驟（d)獲得的AAV載體混合物中的miRNA的核酸的步驟。
[0012] 發(fā)明效果 按照本發(fā)明，提供能夠產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞。通過(guò)使用所述細(xì)胞，可在沒(méi)有復(fù)雜操作的 情況下產(chǎn)生具有高于通過(guò)常規(guī)方法獲得的載體的滴度的AAV載體。另外，提供包括使用所 述細(xì)胞產(chǎn)生AAV載體的方法和試劑盒。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 能夠產(chǎn)生本發(fā)明的AAV載體的細(xì)胞（下文亦稱(chēng)為本發(fā)明的細(xì)胞）是表達(dá)產(chǎn)生AAV 載體所必需的元件和人工導(dǎo)入的miRNA的細(xì)胞。本發(fā)明的產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞是導(dǎo)入了待 包封入病毒顆粒中的核酸的本發(fā)明細(xì)胞。
[0014] 為了產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)胞，待用作材料的細(xì)胞不受特別限制。細(xì)胞的實(shí)例包括哺乳 動(dòng)物（例如人、猴和嚙齒動(dòng)物）的細(xì)胞，其優(yōu)選的實(shí)例包括293細(xì)胞（ATCC CRL-1573)、293T 細(xì)胞（ATCC CRL-11268)、293F 細(xì)胞、293FT 細(xì)胞（全部都由 Life Technologies 生產(chǎn)）、 G3T-hi細(xì)胞（W006/035829)和用于AAV載體產(chǎn)生的市購(gòu)可得的細(xì)胞系，例如AAV293細(xì)胞 (由Stratagene Corp.生產(chǎn)），其具有高的轉(zhuǎn)化效率并恒定表達(dá)腺病毒El基因。此外，可 以使用經(jīng)修飾以瞬時(shí)或恒定表達(dá)AAV載體產(chǎn)生所必需的一些蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
[0015] 產(chǎn)生AAV載體所必需的元件的實(shí)例包括：(A) AAV來(lái)源的Rep和Cap蛋白，和（B) 腺病毒來(lái)源的元件，例如Ela、Elb、E2、E4、VARNA基因。用于向本發(fā)明細(xì)胞提供形成AW 載體的病毒顆粒所必需的元件的核酸的實(shí)例包括：(a)編碼Rep蛋白的核酸、編碼Cap蛋白 的核酸，和（b)編碼腺病毒來(lái)源的元件的核酸。這些核酸的形式不受限制?？蓪⒆鳛槟軌?為所用細(xì)胞提供各種元件的一個(gè)或多個(gè)核酸構(gòu)建體的這些核酸插入質(zhì)?；虿《据d體中，然 后可將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中。例如，使用市購(gòu)可得的PAAV-RCl質(zhì)粒和pHelper質(zhì)粒（由 Cell Biolabs, Inc.生產(chǎn)）。編碼Cap蛋白的核酸在不同于編碼的Cap蛋白的可讀框中 編碼形成AAV顆粒所必需的裝配激活蛋白（38861111317-3(31：；^31：；[叩。1'(^6；[11，44?)(?1'0(3· Natl. Acad Sci. USA, 2010，第 107卷，第 10220-10225 頁(yè)）。除非另有說(shuō)明，否則本 文所用的"編碼Cap蛋白的核酸"意指除Cap蛋白以外還編碼AAP的核酸。當(dāng)破壞AAP功 能的這類(lèi)突變（自發(fā)或人為地）發(fā)生在編碼Cap蛋白的核酸中時(shí)，可將編碼AAP的核酸進(jìn) 一步導(dǎo)入本發(fā)明的細(xì)胞中。因?yàn)榫幋aEla和Elb蛋白的核酸被插入上述293細(xì)胞等的基因 組中并恒定表達(dá)，因此不需要將該核酸導(dǎo)入細(xì)胞中。必要時(shí)，可根據(jù)所用的細(xì)胞，導(dǎo)入編碼 Ela和Elb蛋白的核酸。
[0016] 用于導(dǎo)入核酸構(gòu)建體的方法的實(shí)例包括瞬時(shí)導(dǎo)入方法和恒定導(dǎo)入方法。瞬時(shí)導(dǎo) 入方法不受特別限制，可采用已知的瞬時(shí)導(dǎo)入方法，包括磷酸鈣方法、脂轉(zhuǎn)染方法、DEAE葡 聚糖方法、聚乙烯亞胺方法和電穿孔方法。此外，可使用市購(gòu)可得的試劑，例如Tran s IT (注冊(cè)商標(biāo)）_293 Reagent、TransIT (注冊(cè)商標(biāo)）_2〇2〇 (由 Mirus Bio LLC 生產(chǎn)）、 Lipofectamine 2000 Reagent (由 Life Technologies 生產(chǎn)）、Lipofectamine 2000CD Reagent (由 Life Technologies 生產(chǎn)）、FuGene (注冊(cè)商標(biāo)）Transfection Reagent (由 Promega ΚΚ·生產(chǎn)）等。
[0017] 將核酸恒定導(dǎo)入細(xì)胞的方法不受特別限制，可采用已知的恒定導(dǎo)入方法，包括： 包括使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法和包括以與用于質(zhì)粒的瞬時(shí)導(dǎo)入方法相同的方式將核酸 導(dǎo)入細(xì)胞中并選擇其中核酸整合到染色體的細(xì)胞的方法。對(duì)于包括使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體 的方法，可使用市購(gòu)可得的試劑，例如反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建系統(tǒng)（Retrovirus Constructive System)(由 Takara Bio Inc.生產(chǎn)）。
[0018] 本發(fā)明中miRNA的優(yōu)選實(shí)例是通過(guò)在產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞中表達(dá)miRNA可引起產(chǎn) 生AAV載體的細(xì)胞產(chǎn)生AAV載體的能力提高的miRNA。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員采用本文公開(kāi)的選擇方法（下文亦稱(chēng)本發(fā)明的選擇方法），可容 易地選擇通過(guò)在產(chǎn)生AAV載體的細(xì)胞中表達(dá)miRNA可引起