一類(lèi)抗her2雙靶向抗體、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一類(lèi)抗HER2雙靶向抗體、其制備方法及其在制備抗體腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)的抗HER2雙靶向抗體，具有類(lèi)似全抗體結(jié)構(gòu)與功能的HER2雙靶向抗體，既保留了全抗體類(lèi)似的功能，又可以雙靶向HER2靶蛋白，具有比單祀向的HER2抗體Trastuzumab、Pertuzumab更好的抗腫瘤活性。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤尤其是惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，在各種疾病中所致死亡中居第二位。而且近年來(lái)，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。惡性腫瘤治療效果差，晚期轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后多不佳。目前臨床上所采用的常規(guī)治療方法如放療、化療和手術(shù)治療雖然在很大程度上緩解了病痛，延長(zhǎng)了生存時(shí)間，但這些方法均存在很大的局限性，其療效難以進(jìn)一步提聞。
[0003]抗體靶向性藥物具有特異性好、副作用小、半衰周期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)今已經(jīng)成功應(yīng)用于腫瘤的臨床治療?？贵w藥物在臨床治療中已經(jīng)取得了令人鼓舞的治療效果。1998年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了抗HER2人源化抗體曲妥珠單抗(Trastuzumab,赫賽汀，herceptin)用于治療HER2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌，成為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)上市的治療乳腺癌的人源化單克隆抗體。它是通過(guò)基因工程方法，將非特異的人IgG穩(wěn)定區(qū)與特異的鼠抗HER2抗原決定簇組合在一起設(shè)計(jì)人源化單抗，能與HER2胞外結(jié)構(gòu)域IV特異性結(jié)合。赫賽汀自1998年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市以來(lái)，目前已獲準(zhǔn)用于新輔助、輔助及晚期HER2陽(yáng)性乳腺癌的治療。赫賽汀與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高HER2陽(yáng)性乳腺癌患者的治療效果；赫賽汀與靶向治療藥物，如:拉帕替尼、貝伐單抗、帕妥珠單抗、T-DM1、來(lái)那替尼等聯(lián)合應(yīng)用也顯示了較好的效果。進(jìn)一步研究和探討赫賽汀與其它靶向藥物聯(lián)合，為HER2陽(yáng)性乳腺癌患者提供更多選擇也是臨床所需要的。但是在臨床治療過(guò)程中Trastuzumab單藥的反應(yīng)率不高，大約12%_34%，其中位生存時(shí)間為平均9個(gè)月。因此，大多數(shù)HER2過(guò)表達(dá)腫瘤對(duì)Trastuzumab單藥治療耐受。事實(shí)上，在過(guò)表達(dá)HER2蛋白的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，對(duì)Trastuzumab單藥治療的原發(fā)性耐藥高達(dá)66%到88%。進(jìn)一步的臨床III期實(shí)驗(yàn)證實(shí),Trastuzumab與紫杉醇或者多西他賽聯(lián)合用藥能夠增加反應(yīng)率，延緩病情進(jìn)展和延長(zhǎng)生存時(shí)間。但是即使與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，患者在一年之內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生對(duì)該治療方法的抵制和耐受。因此，設(shè)計(jì)具有更強(qiáng)抗腫瘤活性的新型HER2抗體，是現(xiàn)在乳腺癌治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0004]Pertuzumab是最近被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療的另一個(gè)HER2人源化單克隆抗體，其能夠結(jié)合在HER2胞外結(jié)構(gòu)域II區(qū)域，通過(guò)抑制HER2/HER3異源二聚體的形成，下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路的活化水平。而Trastuzumab結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域IV,在存在配體的情況下，僅表現(xiàn)出較弱的抑制HER2/HER3 二聚化的作用，目前認(rèn)為Pertuzumab作用機(jī)制與Trastuzumab的作用機(jī)制互補(bǔ)。Pertuzumab在臨床試驗(yàn)中對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，現(xiàn)作為輔助治療正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。此外，體內(nèi)和體外的臨床前試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Trastuzumab與Pertuzumab的聯(lián)合用藥對(duì)HER2過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系表現(xiàn)出協(xié)同互補(bǔ)的抗腫瘤效果。值得注意的是，在人乳腺癌的小鼠模型中，對(duì)Trastuzumab治療后腫瘤仍然進(jìn)展的小鼠接受Trastuzumab與Pertuzumab治療能夠協(xié)同增加對(duì)腫瘤的抑制活性。近期報(bào)道的，一個(gè)針對(duì)HER2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌采用Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)合用藥的II期臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)與上述臨床前試驗(yàn)結(jié)果相一致。他們的結(jié)果表明，兩個(gè)抗體的聯(lián)合應(yīng)用在臨床治療中耐受性好，其臨床獲益率為50%。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了另一個(gè)臨床試驗(yàn)用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)合用藥獲得如此令人鼓舞的臨床療效中所起的作用。他們的結(jié)果表明，在早期Trastuzumab治療后進(jìn)展的HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，采用Pertuzumab單藥治療療效欠佳,其臨床獲益率僅為10.3%。而采用Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)合用藥表現(xiàn)出比Pertuzumab單藥治療更加強(qiáng)烈的抗腫瘤活性,其臨床獲益率為41.2%。近期,采用Trastuzumab、Pertuzumab和多西他賽聯(lián)合用藥作為一線(xiàn)用藥用于治療HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床數(shù)據(jù)表明，與安慰劑、Trastuzumab和多西他賽聯(lián)合用藥相比，三者聯(lián)合用藥沒(méi)有增加心臟毒性，而且能夠顯著延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期。這些臨床前和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)提示Trastuzumab治療耐藥后HER2蛋白仍然能夠作為一個(gè)有治療價(jià)值的祀點(diǎn)，同時(shí)祀向Trastuzumab與Pertuzumab作用的HER2胞外結(jié)構(gòu)域IV和II能夠克服Trastuzumab治療耐受。
[0005]然而，幾個(gè)單克隆抗體的聯(lián)合用藥大大增加了家庭與社會(huì)的衛(wèi)生保健成本和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。更加重要的是，由于目前已經(jīng)上市的治療性抗體數(shù)量不多，聯(lián)合用藥的選擇受到限制。更重要的是，由于腫瘤發(fā)生的復(fù)雜性，僅僅依靠靶向單個(gè)位點(diǎn)的單克隆抗體很難更加有效的殺傷腫瘤，克服腫瘤治療復(fù)發(fā)。因此，為更好的解決單克隆抗體靶向單一，增強(qiáng)抗體的抗腫瘤活性等問(wèn)題，設(shè)計(jì)一個(gè)新型既具有雙靶向抗體優(yōu)點(diǎn)，又具有類(lèi)似全抗體結(jié)構(gòu)與功能優(yōu)勢(shì)的，具有強(qiáng)烈抗腫瘤活性的雙靶點(diǎn)抗HER2抗體，是目前亟待解決的問(wèn)題。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
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為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了長(zhǎng)期研究，經(jīng)大量試驗(yàn)，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一類(lèi)既具有類(lèi)似全抗體結(jié)構(gòu)與功能，又能夠雙靶向靶蛋白的新型HER2抗體，該抗體既保留了類(lèi)似全抗體殺傷腫瘤的優(yōu)勢(shì)，又能夠雙靶向HER2蛋白，表現(xiàn)出比單藥親本抗體，甚至比Trastuzumab與Pertuzumab聯(lián)合用藥更好的抗腫瘤活性。
[0007]本發(fā)明公開(kāi)了:
1.一種具有類(lèi)似全抗體結(jié)構(gòu)與功能的新型HER2雙祀向抗體Tras-Per CrossMab及Tras-Permut CrossMab,其特征是既具有與HER2全抗體類(lèi)似的結(jié)構(gòu)與功能,又能夠雙革巴向HER2蛋白。
[0008]2.上述的雙革巴向抗體Tras-Per CrossMab,由四條肽鏈構(gòu)成,分別為T(mén)rastuzumab重鏈knob突變體,Trastuzumab輕鏈,Pertuzumab重鏈hole突變體,Pertuzumab輕鏈突變體 PerLV-CHl。
[0009]3.上述的雙祀向抗體Tras-Permut CrossMab,由四條肽鏈構(gòu)成，分別為T(mén)rastuzumab 重鏈 knob 突變體，Trastuzumab 輕鏈，Pertuzumab 重鏈 hole 突變體，Pertuzumab 輕鏈突變體 PerLV (L56TY) -CHl。
[0010]4.一種分離的核苷酸分子,編碼組成上述Tras-Per CrossMab的四條肽鏈,分別為T(mén)rastuzumab重鏈knob突變體,Pertuzumab重鏈hole突變體以及Trastuzumab輕鏈及Pertuzumab輕鏈突變體PerLV-CHl所述核苷酸序列。
[0011]5.一種分離的核苷酸分子,編碼組成上述Tras-Permut CrossMab的四條肽鏈,分別為T(mén)rastuzumab重鏈knob突變體,Pertuzumab重鏈hole突變體以及Trastuzumab輕鏈及 Pertuzumab 輕鏈突變體 PerLV (L56TY) -CHl。
[0012]6.一種載體，含有上所述的 Tras-Per CrossMab 或者 Tras-Permut CrossMab 核苷酸分子和所述核苷酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列，其中載體可以為PDR1，pcDNA3.1 ( + )，pcDNA3.1/ZEO ( + )，pDHFR 之一。
[0013]7.上述載體，為 pDRl，pcDNA3.1 ( + )，pcDNA3.1/ZEO ( + )，pDHFR 之一。
[0014]8.一種宿主細(xì)胞，含有上述的載體，為真核細(xì)胞。
[0015]9.上述宿主細(xì)胞，為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0016]10.上述宿主細(xì)胞，為CHO細(xì)胞。
[0017]11.一種制備上述Tras-Per雙祀向抗體,該方法包括:
a)分別克隆Her2抗體Trastuzumab重鏈可變區(qū)及Pertuzumab重、輕鏈可變區(qū)；
b)在抗體Fe區(qū)域分別構(gòu)建knob突變體:T366W,S354C; hole突變體:T366S，L368A,Y407V 和 Y394C ；
c )將Pertuzumab輕鏈可變區(qū)與抗體重鏈恒定區(qū)I (CHl)融合構(gòu)建PerLV-CHl融合片斷，將Pertuzumab輕鏈可變區(qū)突變體L56TY與抗體重鏈恒定區(qū)CHl融合構(gòu)建PerLV (L56TY) -CHl 融合片斷；
d)分別將Trastuzumab重鏈可變區(qū)與knob突變體融合，Pertuzumab重鏈可變區(qū)與抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)及hole突變體融合PerHV-CL-Hinge-CH2-CH3，裝入表達(dá)載體；
e)將構(gòu)建好的分別裝入Trastuzumab重鏈knob突變體(SEQID NO: 17), Pertuzumab重鏈 hole 突變體(SEQ ID NO:19)以及 Trastuzumab 輕鏈(SEQ ID NO:25)及 Pertuzumab輕鏈突變體(SEQ ID NO:21)的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)行表達(dá)，分離純化。
[0018]f)將構(gòu)建好的分別裝入Trastuzumab重鏈knob突變體(SEQ ID NO:17),Pertuzumab 重鏈 hole 突變體(SEQ ID NO: 19)以及 Trastuzumab 輕鏈(SEQ ID NO:25)及Pertuzumab輕鏈突變體PerLV (L56TY)-CHl (SEQ ID NO:23)的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染進(jìn)行表達(dá)，分離純化。
[0019]12.一種組合物，含有上述Tras-Per雙靶向抗體，和藥學(xué)上可接受的載體。
[0020]13.上述Tras-Per雙靶向抗體在制備抗體腫瘤藥物中的用途。
[002