一株高凝聚性戊糖片球菌及其在凈化水體中副溶血性弧菌中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株從發(fā)酵豆制品中篩選出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在凈化水體中的副溶血性弧菌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]副溶血性弧菌(Vibr1 parahaemolyticus)，廣泛分布于近岸海洋及江河入海口，是海產(chǎn)品引發(fā)食物中毒的重要病原菌，也是水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的重要致病因子。目前，防治水生動(dòng)物弧菌病、降低水體中副溶血性弧菌載量的重要手段是使用抗生素及化學(xué)制劑，但隨之導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生及抗生素殘留等問(wèn)題，對(duì)食品安全造成重大影響，因此亟需開發(fā)新的手段來(lái)進(jìn)行水體減菌和凈化處理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株具有高凝聚活性的戊糖片球菌，可用于水體中的副溶血性弧菌的減菌和凈化處理，而避免使用化學(xué)抑菌劑和抗生素來(lái)進(jìn)行水體減菌和凈化處理，為養(yǎng)殖和暫養(yǎng)水體中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同時(shí)有利于預(yù)防副溶血性弧菌引起的水生動(dòng)物疾病和食源性疾病的傳播。
[0004]本發(fā)明從發(fā)酵豆制品鹵水中分離出一株戊糖片球菌F28-8 (Ped1coccuspentosaceus)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，其菌種保藏編號(hào)為:CGMCCN0.9956，保藏日期為2014年11月13日，菌種的分類命名為戊糖片球菌，Ped1coccuspentosaceuso
[0005]本發(fā)明中的戊糖片球菌F28-8具有以下生物學(xué)特性:
(O形態(tài)特征:戊糖片球菌F28-8革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性，細(xì)胞呈圓球形，成對(duì)或四聯(lián)排列，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛。
[0006](2)菌落特征:戊糖片球菌F28-8在MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)為圓形、乳白色、光滑、凸起，邊緣整齊，不透明。
[0007](3)生理生化特征:過(guò)氧化氫酶陰性，不產(chǎn)生吲哚、硫化氫和氨，不還原硝酸鹽，不水解精氨酸，可發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可從纖維二糖、七葉苷、蘀糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖發(fā)酵產(chǎn)酸。
[0008](4)對(duì)副溶血性弧菌具有強(qiáng)烈的凝聚性和抑菌性。
[0009]本發(fā)明從發(fā)酵豆制品中的戊糖片球菌中分離出戊糖片球菌分離株，通過(guò)測(cè)定其對(duì)副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力，篩選出具有高凝聚力的戊糖片球菌，并通過(guò)電鏡來(lái)觀察不同凝聚力的戊糖片球菌菌株的表面微觀結(jié)構(gòu)，測(cè)定其對(duì)水體中致病性副溶血性弧菌存活率的影響來(lái)考察其對(duì)水體中副溶血性弧菌凈化效應(yīng)，具體包括以下步驟: (I)菌株復(fù)蘇培養(yǎng)戊糖片球菌F28-8接種5 mL MRS液體培養(yǎng)基，tdh基因陽(yáng)性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接種LBS液體培養(yǎng)基，備用。
[0010](2)抑菌能力測(cè)定用瓊脂孔擴(kuò)散法，通過(guò)測(cè)定戊糖片球菌菌株無(wú)細(xì)胞提取液對(duì)副溶血性弧菌在LBS固體平板上的抑菌圈的大小來(lái)檢測(cè)其抑菌能力。
[0011](3)共凝聚能力測(cè)定調(diào)節(jié)戊糖片球菌的菌懸液的濃度，將調(diào)好濃度的戊糖片球菌懸液與相應(yīng)的副溶血性弧菌菌懸液各取混合，測(cè)定吸光值，記作Amix，以未混合戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌懸液作為對(duì)照，按照以下公式:{[(Ap+Av)/2]-Amix}/(Ap+Av)/2*100來(lái)計(jì)算細(xì)菌共凝聚率，其中Ap和Av分別為戊糖片球菌和副溶血性弧菌菌懸液在600 nm處測(cè)所測(cè)的A值。
[0012](4)凝聚細(xì)胞的電鏡觀察吸取自凝聚2 h的未混合戊糖片球菌的菌懸液樣品進(jìn)行掃描電鏡，吸取共凝聚2 h的戊糖片球菌和副溶血性弧菌的混合菌懸液樣品進(jìn)行掃描電鏡，分別觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和凝聚特征。
[0013](5)凝聚過(guò)程中副溶血性弧菌存活細(xì)胞測(cè)定將戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌懸液在37°C混合靜置培養(yǎng)2 h、12h、24h、60h、96h后，分別吸取樣品中上層和下層溶液通過(guò)選擇性TCBS瓊脂平板測(cè)定體系中的細(xì)菌濃度。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
戊糖片球菌(Ped1coccus pentosaceus)，是乳酸菌中的一個(gè)種，廣泛分布于蔬菜、干酪、香腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，是公認(rèn)的具有安全性的微生物。該菌代謝糖類產(chǎn)生乳酸，并產(chǎn)生IIa類片球菌素，對(duì)病原菌及腐敗微生物產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制效應(yīng)，其中一些菌株具有提高動(dòng)物天然免疫能力、促進(jìn)健康以及抵抗病原菌的侵襲等益生特性，以戊糖片球菌及其代謝產(chǎn)物研發(fā)新型抑菌劑和微生態(tài)制劑對(duì)食品和環(huán)境中弧菌凈化控制以及弧菌病的生物防治具有潛在價(jià)值和廣闊前景。
[0015]本發(fā)明的戊糖片球菌F28-8對(duì)致病性副溶血性弧菌具有較強(qiáng)的抑菌性能、共凝聚能力，其抑菌活性對(duì)氧化氫酶、蛋白酶以及高溫條件均不敏感，因此可應(yīng)用范圍廣。電鏡顯示該菌具有獨(dú)特的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和細(xì)胞粘聚方式，易于自凝聚形成大的團(tuán)簇，并與副溶血性弧菌形成緊密的共凝聚物，從而對(duì)水體中的副溶血性弧菌的減菌和凈化處理。水體中的副溶血性弧菌經(jīng)戊糖片球菌F28-8的共凝聚作用后，上層懸液和凝聚物中的可培養(yǎng)細(xì)胞均顯著減少。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1:不同凝聚性的戊糖片球菌細(xì)胞的掃描電鏡結(jié)果。
[0017]圖2:戊糖片球菌共凝聚對(duì)水體中副溶血性弧菌可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0019]除非特別說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施例所用培養(yǎng)基和試驗(yàn)條件為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基和試驗(yàn)。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施例所用試劑均為市購(gòu)。
[0020]實(shí)施例1菌株復(fù)蘇培養(yǎng)
將戊糖片球菌保種液于O°C解凍，無(wú)菌吸取200 μ L保種液接種于10 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 °C厭氧條件下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物劃線接種于MRS固體平板上，在37 °C厭氧培養(yǎng)24 h，然后挑取單菌落接種于5 mL的MRS液體培養(yǎng)基，在37°C厭氧條件下培養(yǎng)24 h，備用O
[0021]將tdh基因陽(yáng)性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接種于LBS液體培養(yǎng)基，在37°C振蕩培養(yǎng)16 h;取培養(yǎng)物劃線于TCBS平板，在37°C培養(yǎng)20 h，挑取單菌落接種5 mLLBS液體培養(yǎng)基，在37°C恒溫振蕩條件下培養(yǎng)12 h，備用。
[0022]實(shí)施例2抑菌能力測(cè)定
戊糖片球菌F28-8、Y27-4、Y45-30、H13,、H6、HlO和F3的抑菌能力對(duì)比測(cè)定:
在70°C、100°C、121°C不同溫度下分別將戊糖片球菌培養(yǎng)物12000g離心15 min，取上清液，通過(guò)0.22 Mffl的微孔濾膜除菌，獲得戊糖片球菌培養(yǎng)物無(wú)細(xì)胞提取液。使用瓊脂孔擴(kuò)散法對(duì)菌株無(wú)細(xì)胞提取液的抑菌能力進(jìn)行測(cè)定:用無(wú)菌生理鹽水將副溶血性弧菌的菌懸液稀釋到18 CFU /mL，移取I mL菌懸液于LBS固體平板中，涂布均勻，于超凈工作臺(tái)中晾干15 min，用打孔器在平板中均勻打直徑為10 mm的小孔，每孔加入200μ?戊糖片球菌培養(yǎng)物無(wú)細(xì)胞提取液和用9 mg /mL過(guò)氧化氫酶、I mg /mL蛋白酶K和I mg /mL胰蛋白酶處理。將三個(gè)不同條件70°C、100°C、121°C下處理的菌株分別各做3孔平行，室溫?cái)U(kuò)散5 h，然后放置于37°C下培養(yǎng)過(guò)夜，用游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。將MRS液體培養(yǎng)基用乳酸調(diào)節(jié)PH到與作為對(duì)照的受試菌株無(wú)細(xì)胞提取液的pH相同，并比較不同處理組的抑菌效果。
[0023]本研宄試驗(yàn)中的7株戊糖片球菌的代謝產(chǎn)物對(duì)致病性副溶血性弧菌ATCC33847都顯示了強(qiáng)烈的抑制效應(yīng)，抑菌圈直徑在21.0 mm至25.5mm之間，是同pH乳酸對(duì)照的1.1至
1.3倍，其中F28-8具有最強(qiáng)的抑菌作用。培養(yǎng)上清經(jīng)過(guò)氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K以及加熱處理后抑菌效果有不同程度的降低，但殘留抑菌效果仍在75-96%之間，結(jié)果表明戊糖片球菌F28-8代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸是對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)抑制作用的主要因素，過(guò)氧化氫產(chǎn)生以及細(xì)菌素等蛋白質(zhì)類抑菌成分作用相對(duì)較小。
[0024]實(shí)施例3共凝聚能力測(cè)定
戊糖片球菌F28-8、Y27-4、Y45-30、H13