一種快速選育土霉素菌種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于土霉素菌種選育的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速選育土霉素菌種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土霉素(Spectn1mycni)是龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)有氧發(fā)酵后生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為四環(huán)類(lèi)廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑制能力，對(duì)多種球菌和桿菌有抗菌作用，對(duì)立克次體和阿米巴病蟲(chóng)也有抑制作用，用來(lái)治療上呼吸道感染、胃腸道感染、斑瘆傷寒、恙蟲(chóng)病、支原體和衣原體屬感染等疾病。
[0003]土霉素主要用做畜禽用藥及飼料添加劑，此外，以土霉素為原料生產(chǎn)半合成抗生素的市場(chǎng)前景較好，比如用其合成的強(qiáng)力霉素(多西霉素)，其市場(chǎng)價(jià)格是土霉素的5-7倍，用其為原料生產(chǎn)的美他環(huán)素，臨床效果優(yōu)于土霉素，很多企業(yè)將土霉素、維生素B1、維生素B6等組成復(fù)方土霉素，能使土霉素療效增加，還能降低消化道副反應(yīng)，是良好的動(dòng)物飼料添加劑。因此，對(duì)土霉素菌株的選育和研宄具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中在選育高產(chǎn)量和高通量的土霉素菌株時(shí)，采用的方法是:斜面-孢子懸液-孢子懸液預(yù)處理-分離培養(yǎng)基-斜面-種瓶培養(yǎng)基-發(fā)酵培養(yǎng)基。例如專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01410087566.2的專(zhuān)利《一種土霉素高產(chǎn)菌株及其高通量篩選方法》中即為這種方法，其在制備了種子懸浮液之后還用0.5-1.5uL亞硝基胍溶液對(duì)種子懸浮液進(jìn)行處理，之后才進(jìn)行分離培養(yǎng)，而在分離培養(yǎng)之后，將分離培養(yǎng)得到的單菌落又經(jīng)過(guò)了斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)和種子搖瓶的培養(yǎng)才進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過(guò)這種篩選方法其驗(yàn)證周期長(zhǎng)，影響篩選效率，操作麻煩，篩選通量小，高產(chǎn)菌株的篩出概率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中土霉素工業(yè)菌種的篩選周期長(zhǎng)，影響工作效率的技術(shù)問(wèn)題，提供了一種快速選育土霉素菌種的方法。
[0006]本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種快速選育土霉素菌種的方法，包括以下步驟:
[0008]a.試管斜面培養(yǎng):將土霉素生產(chǎn)菌株砂土孢子接種于試管斜面培養(yǎng)基中，在溫度37.0±0.5°C，濕度40% -60%的條件下培養(yǎng)3_5天，得到斜面孢子；
[0009]b.孢子懸液制備:向步驟a試管斜面培養(yǎng)基中加入無(wú)菌水，將步驟a得到的斜面孢子刮下，混勻，制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子濃度為112-1O14個(gè)/mL ；
[0010]C.分離培養(yǎng):將步驟b所得的孢子懸液用無(wú)菌水稀釋至11-1O7倍，稀釋液涂布在分離培養(yǎng)基上，于溫度37.0±0.50C，濕度40% -60%的條件下暗培養(yǎng)3_5天，培養(yǎng)時(shí)第一天正置，第二天起倒置培養(yǎng)；
[0011]d.發(fā)酵培養(yǎng):在分離培養(yǎng)基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到25mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32.0±0.5°C，濕度為40-60 %，轉(zhuǎn)速為200_220rpm條件下震蕩培養(yǎng)48_50h，生長(zhǎng)到周期后檢測(cè)發(fā)酵液中土霉素含量，選高于效價(jià)500U/mL的菌株進(jìn)行砂土干燥保藏；
[0012]e.菌株復(fù)試:取步驟d沙土干燥保藏的菌株轉(zhuǎn)接試管斜面培養(yǎng)基，于37.0±0.5°C,40% -60%濕度條件下培養(yǎng)3_5天，得斜面孢子，將所得的斜面孢子轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中，于30.0±0.5°C，220rpm條件下震蕩培養(yǎng)24_30h，將培養(yǎng)好的種液轉(zhuǎn)接至復(fù)試用發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30.0±0.5°C，200-220rpm條件下震蕩培養(yǎng)5_7天，取樣檢測(cè)效價(jià)。
[0013]所述的試管斜面培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:6.0% -7.0 %麩皮，2.0% ~2.5%瓊月旨。
[0014]所述的步驟a中，濕度為45% -55%，培養(yǎng)時(shí)間為4天。
[0015]所述的步驟c中，分離培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:2.0% -3.0%玉米淀粉，0.2% -0.5% 玉米漿，0.1% -0.3% 硫酸銨，0.1% -0.5% 碳酸鈣，0.3% -0.5% 氯化鈉，2.0% -2.5%瓊脂。
[0016]所述的步驟c中，濕度為45% -55%，培養(yǎng)時(shí)間為4天。
[0017]所述步驟d中，發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:4% -5%玉米淀粉，0.1% -0.2% 玉米漿，0.5% -1.0% 黃豆粉，0.2% -0.3% 硫酸銨，0.2% -0.3% 碳酸鈣，0.1% -0.2%氯化鈉，0.01% -0.02%磷酸二氫鉀。
[0018]所述步驟d中，濕度為45-55%，轉(zhuǎn)速為220rpm，震蕩培養(yǎng)49h。
[0019]所述步驟e中，種子培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:2.0% -3.0%玉米淀粉，0.2% -0.5% 玉米漿，2.0% -3.0% 黃豆粉，0.1% -0.3% 硫酸銨，0.1% -0.5% 碳酸鈣，0.3% -0.5%氯化鈉。
[0020]所述步驟e中，復(fù)試用發(fā)酵培養(yǎng)基成分及其含量為:10% -15%玉米淀粉，0.2% -0.5% 玉米漿，2.0% -3.0% 黃豆粉，1.0% -L 5% 硫酸銨，1.0% -1.5% 碳酸鈣，0.3% -0.5%氯化鈉，0.01% -0.05%磷酸二氫鉀，0.1% -0.3%聚醚消沫。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明所述快速選育土霉素菌種的方法，通過(guò)將分離培養(yǎng)得到的單菌落直接接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，將土霉素菌種篩選中的效價(jià)驗(yàn)證周期由192h縮短為48-50h，縮短了驗(yàn)證時(shí)間，提高了工作效率，而且選育出的土霉素具有高產(chǎn)的特點(diǎn)。
[0022]原來(lái)的土霉素發(fā)酵技術(shù)采用斜面孢子挖塊的方式接種，而本文方法使用單菌落孢子接種，后者孢子量較小，從而降低發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量，節(jié)省了原料，降低了成本；通過(guò)將分離培養(yǎng)得到的單菌落直接接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中換了一種驗(yàn)證工藝思路，減少了驗(yàn)證工藝中需要的較大的接種量，而在工藝思路改變的前提下，所要解決的技術(shù)關(guān)鍵是單菌落接到發(fā)酵瓶以后的孢子快速生長(zhǎng)繁殖的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，在步驟d發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中由于接種孢子量的減少，在發(fā)酵的研宄中發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)孢子的萌發(fā)、菌絲的生長(zhǎng)繁殖、抗生素的產(chǎn)生有著至關(guān)重要的影響，將溫度控制在32.0±0.5°C，并同時(shí)需要將步驟d中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方嚴(yán)格控制為“4% -5%玉米淀粉，0.1% -0.2%玉米漿，0.5% -1.0%黃豆粉，0.2% -0.3%硫酸銨，0.2% -0.3%碳酸鈣，0.1% -0.2%氯化鈉，0.01% -0.02%磷酸二氫鉀”在較低的淀粉、黃豆粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)下配合32.0±0.5°C的培養(yǎng)溫度才能實(shí)現(xiàn)孢子快速萌發(fā)、菌絲快速生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)生抗生素。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中土霉素工業(yè)菌種的篩選周期長(zhǎng)，影響工作效率的技術(shù)問(wèn)題，提供了一種快速選育土霉素菌種的方法。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024]實(shí)施例1.
[0025]試管斜面培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:6.0% -7.0%麩皮，2.0% -2.5%瓊脂。
[0026]分離培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:2.0% -3.0%玉米淀粉，0.2% -0.5%玉米漿，0.1% -0.3%硫酸銨，0.1% -0.5%碳酸鈣，0.3% -0.5%氯化鈉，2.0% -2.5%瓊脂。
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:4% -5%玉米淀粉，0.1% -0.2%玉米漿，0.5% -1.0 % 黃豆粉，0.2% -0.3% 硫酸銨，0.2% -0.3% 碳酸鈣，0.1% -0.2% 氯化鈉，0.01% -0.02%磷酸二氫鉀。
[0028]a.試管斜面培養(yǎng):將土霉素生產(chǎn)菌株砂土孢子接種于試管斜面培養(yǎng)基中，每支試管斜面的砂土孢子接種量為，在溫度37.0±0.5°C，濕度40%的條件下培養(yǎng)5天，得到斜面孢子；
[0029]b.孢子懸液制備:向步驟a試管斜面培養(yǎng)基中加入無(wú)菌水，將步驟a得到的斜面孢子刮下，混勻，制成孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使孢子濃度為112-1O14個(gè)/mL ;
[0030]c.分離培養(yǎng):將步驟b所得的孢子懸液稀釋至11-1O7倍，稀釋液涂布在分離培養(yǎng)基上，于溫度37.0±0.50C，濕度40%的條件下暗培養(yǎng)5天，培養(yǎng)時(shí)第一天正置，第二天起倒置培養(yǎng)；
[0031]d.發(fā)酵培養(yǎng):在分離培養(yǎng)基上挑取直徑在5mm以上的單菌落接種到25mL發(fā)酵