的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較 佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法 和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0034] 本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。
[0035] 其中，脂肪干細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自廣州儀濤廣州儀濤科學(xué)儀器有限公司
[0036] 表皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)基SFM購(gòu)自購(gòu)自廣州儀濤廣州儀濤科學(xué)儀器有限公司
[0037] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0038] 實(shí)施例1人脂肪干細(xì)胞（ADSCs)的分離與培養(yǎng)
[0039] 通過脂肪抽吸術(shù)獲取的人體腹部皮下脂肪組織抽提液（術(shù)前己排除內(nèi)分泌疾病 及傳染?。?00g離心，用PBS緩沖液沖洗，浸泡，再800gx4min洗滌3次。
[0040] 剔除肉眼可見的血管及結(jié)蹄組織，用眼科剪將其充分剪碎后放入50ml離心管，加 入2倍體積0. 5 %膠原酶、1倍體積1 % BSA和雙抗，混勾，封口，放入搖床中37°C消化50min， 至糊狀為止。
[0041] 加入等體積的含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的低糖DMEM終止消化，1800r/min離心 lOmin，離心后分為3層，上層為油脂及未消化完全的脂肪組織，中層為上清液，下層為脂肪 干細(xì)胞和紅細(xì)胞等混合細(xì)胞的沉淀。
[0042] 棄上層和中層，下層加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，70um細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，
[0043] 將濾過后的濾液調(diào)整細(xì)胞濃度為5x10s單核細(xì)胞/mL接種于T-25cm 2培養(yǎng)瓶中， 37°C、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)。
[0044] 48h后換液，加入脂肪干細(xì)胞完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0045] 細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合時(shí)，采用0. 25%胰蛋白酶/0. 02% EDTA消化傳代至第三代? 第五代。
[0046] 期間用倒置顯微鏡觀察，觀察結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示：原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后，可 見少量細(xì)胞貼壁；48h后（圖1-a)，倒置顯微鏡下見圓形、短梭形、不規(guī)則形細(xì)胞；換液后， 細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，梭形細(xì)胞明顯增多，部分細(xì)胞可見多個(gè)突起，4-5天（圖1-b)開始單層融合， 呈成纖維樣細(xì)胞，生長(zhǎng)迅速，3天傳代一次，隨著代數(shù)增多，細(xì)胞形態(tài)逐漸均一。
[0047] 實(shí)施例2人脂肪干細(xì)胞（ADSCs)表面標(biāo)記的鑒定
[0048] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代的細(xì)胞，吸出培養(yǎng)基后，加入0. 25 %胰蛋白酶+0.02 % EDTA 的消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液。
[0049] IOOOrpm,離心lOmin，棄上清，用4°C預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次后重懸均勻，調(diào)整細(xì) 胞濃度約為IO 5-IO6個(gè)/ml。
[0050] 取2個(gè)上樣管，每管加入500ul的單細(xì)胞懸液，離心后1號(hào)管標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，2號(hào)各 加入2 y IFITC或PE標(biāo)記的小鼠抗人細(xì)胞表面分子⑶59、⑶45、⑶34、⑶105抗體工作液。
[0051] 室溫，避光，孵育20min。
[0052] PBS洗兩遍，以去除未結(jié)合的抗體，500ul的1640培養(yǎng)基重懸后，上流式細(xì)胞儀鑒 定表面標(biāo)記。
[0053] 鑒定結(jié)果如圖2所示，以未加抗體的實(shí)驗(yàn)為對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs表面抗原 顯示：擴(kuò)增第3代的ADSCs⑶59、⑶90呈陽性表達(dá)，而HLA-DR、⑶45呈陰性表達(dá)，符合干細(xì) 胞的特性。
[0054] 實(shí)施例3人脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
[0055] 取實(shí)施例1制得的取第三代?第五代的ADSCs，吸去培養(yǎng)上清后，加入0. 25%胰蛋 白酶+0. 02% EDTA的消化液進(jìn)行消化，之后用適量血清終止消化。1200r/min離心5min，月旨 肪干細(xì)胞完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度為IxlOVml，接種于6孔板中，每孔2ml。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 40% -50%融合時(shí)，應(yīng)用表1所示培養(yǎng)基，同樣環(huán)境下誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2天更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培 養(yǎng)7天后，取部分細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，其余細(xì)胞用表皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)基SFM繼續(xù)培養(yǎng)、傳 代，每2天更換完全培養(yǎng)基一次。
[0056] 表1脂肪干細(xì)胞成表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0057]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法，其特征在于，將脂肪干細(xì)胞于EGF、 bFGF、ATRA和IGF-1存在條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到表皮細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含有5wt% FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述EGF的濃度為15?25ng/mL ;bFGF的 濃度為3?7ng/mL ;ATRA的濃度為3?7 ymol/L ;IGF_1的濃度為3?7ng/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還包括地塞米 松。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述地塞米松的濃度為0.01? 0?2 y mol/L〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為7d，溫度為37°C， 〇)2體積分?jǐn)?shù)5 %，飽和濕度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述脂肪干細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)前經(jīng)胰蛋白 酶消化、融合，具體為：取第三代?第五代的脂肪干細(xì)胞，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%胰蛋白酶 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 02% EDTA進(jìn)行消化，以血清終止消化后1200r/min離心5min，以DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1 X 104/mL，培養(yǎng)至40 %?50 %融合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?7任一項(xiàng)提供的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)后，還包括擴(kuò)增 培養(yǎng)、傳代的步驟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代的培養(yǎng)基為表皮細(xì)胞 無血清培養(yǎng)基SFM。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1提供的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代的條件為溫度為 37 °C，0)2體積分?jǐn)?shù)5 %，飽和濕度95 %。
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細(xì)胞誘導(dǎo)領(lǐng)域，尤其涉及誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞分化為表皮細(xì)胞的方法。該方法為將脂肪干細(xì)胞于EGF、bFGF、ATRA和IGF-1存在條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到表皮細(xì)胞。經(jīng)試驗(yàn)證明，采用本發(fā)明提供的方法，培養(yǎng)7天后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，由梭形的脂肪干細(xì)胞變化為橢圓形或圓形，CK10的表達(dá)量升高11倍，CK19的表達(dá)量升高78倍，顯著優(yōu)于對(duì)照組。說明，采用本發(fā)明提供的方法，誘導(dǎo)7天后能夠成功將脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化稱為成纖維細(xì)胞，且分化速度優(yōu)于對(duì)照組。繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)、傳代過程中，細(xì)胞進(jìn)一步的分化、擴(kuò)增，從而能夠獲得更大量的表皮細(xì)胞。
【IPC分類】C12N5-071
【公開號(hào)】CN104611290
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510070099
【發(fā)明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 馬巖巖, 王小燕
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年2月10日