一種提高l-天冬酰胺酶分泌表達(dá)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高L-天冬酰胺酶分泌表達(dá)的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-天冬酰胺酶（EC3. 5. I. 1)是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對(duì)某些腫瘤的抑制作用，尤 其對(duì)急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物， 對(duì)骨髓細(xì)胞沒(méi)有抑制作用。L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要 是由食品原料中的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過(guò)程中通過(guò)美拉德反應(yīng)生成，在食物中加 入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。
[0003] -些微生物、哺乳動(dòng)物及植物被證實(shí)含有L-天冬酰胺酶。因?yàn)閯?dòng)物血清中L-天 冬酰胺酶含量低，且提取工藝復(fù)雜，微生物具有易培養(yǎng)，成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為學(xué)者研宄的重 點(diǎn)，目前研宄的產(chǎn)L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、 Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶產(chǎn)量低，近年來(lái)利用基因工程技術(shù)將 L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中，獲得L-天冬酰胺酶的高效表達(dá)，利用工程菌產(chǎn)L-天 冬酰胺酶已成為一個(gè)重要來(lái)源。
[0004] 本發(fā)明通過(guò)在大腸桿菌中共表達(dá)帶有信號(hào)肽的天冬酰胺酶及信號(hào)肽切割酶1印B， 得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明首先要解決的問(wèn)題是提供一種提高天冬酰胺酶分泌表達(dá)的方法，是將信號(hào) 肽融合至天冬酰胺酶的N端，將編碼該融合有信號(hào)肽的天冬酰胺酶的基因與信號(hào)肽切割酶 基因在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。
[0006] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述信號(hào)肽的基因如SEQ ID NO. 1?8任一所 不O
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述信號(hào)肽是pelB。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述天冬酰胺酶來(lái)源于枯草芽孢桿菌。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO. 9所 不O
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述信號(hào)肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO. 10 所示。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以載體pET_20b(+)表達(dá)編碼融合有信號(hào)肽的天冬 酰胺酶的基因。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以載體pRSF-duet(+)表達(dá)編碼信號(hào)肽切割酶的基 因。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將含有編碼融合有信號(hào)肽的天冬酰胺酶的基 因與載體PET-20M+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3);將信號(hào)肽酶基因1印B連接 pRSF-duet (+)，轉(zhuǎn)化上一步得到的重組菌。挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng) 12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，接種量為3%。菌體長(zhǎng)到OD6c?為1. 5時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培 養(yǎng)溫度降到30°C，培養(yǎng)24h。收集發(fā)酵上清，分離得到天冬酰胺酶。
[0015] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種胞外分泌天冬酰胺酶能力增強(qiáng)的重 組菌，是將信號(hào)肽融合至天冬酰胺酶的N端，將編碼該融合有信號(hào)肽的天冬酰胺酶的基因 與信號(hào)肽切割酶基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行共表達(dá)得到的。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述信號(hào)肽的基因如SEQ ID NO. 1?8任一所 不O
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述信號(hào)肽是pelB，編碼pelB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述天冬酰胺酶來(lái)源于枯草芽孢桿菌。
[0019] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO. 9所 不O
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述信號(hào)肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO. 10 所示。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以載體pET_20b(+)表達(dá)編碼融合有信號(hào)肽的天冬 酰胺酶的基因。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以載體pRSF-duet (+)表達(dá)編碼信號(hào)肽切割酶的基 因。
[0023] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主。
[0024] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將含有編碼融合有信號(hào)肽的天冬酰胺酶的基 因與載體pET-20b(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3);將信號(hào)肽酶基因1印B連接 pRSF-duet (+)，轉(zhuǎn)化上一步得到的重組菌，篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
[0025] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述胞外分泌天冬酰胺酶能力增強(qiáng)的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)天 冬酰胺酶的方法，是將重組菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中， 接種量為3%;菌體長(zhǎng)到0D_為1. 5時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培養(yǎng)溫度降到30°C，培養(yǎng)24h。 收集發(fā)酵上清，分離得到天冬酰胺酶。
[0026] 本發(fā)明通過(guò)在天冬酰胺酶的N端融合pelB信號(hào)肽，使重組菌的胞外天冬酰胺酶酶 活提高了 20倍，進(jìn)一步共表達(dá)1印B信號(hào)肽酶，可將天冬酰胺酶酶活在此基礎(chǔ)上提高1. 45 倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力顯著提高，更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1融合表達(dá)不同信號(hào)肽對(duì)胞外天冬酰胺酶產(chǎn)量的影響
[0028] 圖2共表達(dá)信號(hào)肽酶對(duì)胞外天冬酰胺酶產(chǎn)量的影響
[0029] 圖3天冬酰胺酶生產(chǎn)菌株蛋白電泳圖；I !Marker，2 :R20b-pelB胞外，3 : R20b-pelB/pRSF-duet-l印B 胞外，4 :R20b-pelB 胞內(nèi)，5 :R20b-pelB/pRSF-duet-l印B 胞內(nèi)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7· 0。
[0031] TB 培養(yǎng)基：蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L，甘油 8g/L，17mmol/LKH2P04,72mmol/L K2HPO 40
[0032] 采用分光光度法測(cè)定天冬酰胺酶酶活，1個(gè)單位天冬酰胺酶酶活定義為：酶活定 義：在37°C反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)能催化L-天冬酰胺釋放1 μ mol NH3所需要的酶量為一個(gè) 酶活單位（U/ml)。酶活測(cè)定條件：37°C條件下，ImllOmM K2HPO4-KH2PO4(PH7. 5)，0· lmll89mM 天冬酰胺，〇. 3ml發(fā)酵上清液，保溫30分鐘，0. lmll. 5M TCA終止反應(yīng)。利用Shimadzu UV-1240在436nm處測(cè)定吸光值，通過(guò)硫酸銨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。
[0033] 實(shí)施例1天冬酰胺酶基因融合信號(hào)肽
[0034] 信號(hào)肽 pelB 的核苷酸序列：ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCGGTCTGCTGCTCCTCG CTGCCCAGCCGGCGATGGCC
[0035] 信號(hào)肽 ompA 的核苷酸序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGITTC GCTACCGTAGCGCAGGCCGCTCCG
[0036] 信號(hào)肽 torT 的核苷酸序列：ATGCGCGTACTGCTATTTTTACTTCTTTCCCTTTTCATGTTGCCG GCATTTTCGGCTGAT
[0037] 信號(hào)肽 TorA 的核苷酸序列：ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGCATCACGTCGGCGTTTTCTG GCACAACTCGGCGGCTTAACCGTCGCCGGGATGCTGGGGCCGTCATTGTTAACGCCGCGACGTGCGACTGCGGCGCA AGCG
[0038] 信號(hào)肽 sufl 的核苷酸序列：ATGTCACTCAGTCGGCGTCAGTTCATTCAGGCATCGGGGATTGCA CTTTGTGCAGGCGCTGTTCCCCTGAAGGCCAGCGCAGCCGGG
[0039] 信號(hào)肽 DsbA 的核苷酸序列：ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTT AGCGCATCGGCGGCGCAG
[0040] 信號(hào)肽 Dmsa 的核苷酸序列：ATGGAACGCAGAAGITTTCTAAAAATGAGTGCAGCCATGGGCTGC GCAGCAACGGTCACTGGCTGT
[0041] 信號(hào)肽 ansZ 的核苷酸序列：ATGAAAAAACAACGAATGCTCGTACTTTTTACCGCACTATTGTTT GTTTTTACCGGA
[0042] 合成 8 種信號(hào)肽：pelB、ompA、sufl、DsbA、Dmsa、TorT、TorA、ansZ。PCR 反應(yīng)條件 為：94°C 5min，30 個(gè)循環(huán)（98°C 15s、50°C 15s、72°C 20s)，72°C 10min。以 pET-22b(+)-ansZ 作為模版，以pl、p2作為正、反向引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出一條具有N-末端His標(biāo)簽但缺失天 然信號(hào)肽的天冬酰胺酶基因。PCR反應(yīng)條件為：94°C 5min，30個(gè)循環(huán)（98°C 15s、50°C 15s、 72°C 80s)，72°C 10min。PCR 擴(kuò)增體系：模板 I yL，上下游引物各 I yL，dNTP Mix4yL， 5XprimeSTARBufferl0yL，滅菌的雙蒸水 32.5yL，primeSTAR DNA 聚合酶 0.5yL。采用 膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，電泳檢驗(yàn)回收產(chǎn)物的濃度。通過(guò)重疊 PCR的方 式，將信號(hào)肽與天冬酰胺酶進(jìn)行融合。
[0043] Pl:TGTTCACATTCTCCTGAAACAAAAG
[0044] P2: CCGCTCGAGTCAATACTCATTGAAATAAGCTTGG (下劃線 XhoI 酶切位點(diǎn)）
[0(Μ5] 表1引物序列
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高天冬酰胺酶分泌表達(dá)的方法，其特征在于，將信號(hào)肽融合至天冬酰胺酶的 N端，將編碼該融合有信號(hào)肽的天冬酰胺酶的基因與信號(hào)肽切割酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行 共表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述信號(hào)肽的基因如SEQ ID NO. 1? 8任一所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO. 9 所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，編碼所述信號(hào)肽切割酶的基因序列如SEQ ID NO. 10 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以載體pET-20b(+)表達(dá)編碼融合有信號(hào) 肽的天冬酰胺酶的基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以載體pRSF-duet(+)表達(dá)編碼信號(hào)肽切 割酶的基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將含有編碼融合有信號(hào)肽的天冬酰胺酶 的基因與載體口￡!'-2013(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌1? 〇%?&(0￡3);將信號(hào)肽酶基因1印8連接 pRSF-duet (+)，轉(zhuǎn)化上一步得到的重組菌；挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 12h，轉(zhuǎn)接到TB培養(yǎng)基中，接種量為3 %;菌體長(zhǎng)到00_為1. 5時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，并將培養(yǎng) 溫度降到30°C，培養(yǎng)24h，收集發(fā)酵上清，分離得到天冬酰胺酶。
9. 一種胞外分泌天冬酰胺酶能力增強(qiáng)的重組菌，其特征在于，是將信號(hào)肽融合至天冬 酰胺酶的N端，將編碼該融合有信號(hào)肽的天冬酰胺酶的基因與信號(hào)肽切割酶基因轉(zhuǎn)化大腸 桿菌進(jìn)行共表達(dá)得到的。
10. 權(quán)利要求9所述的重組菌在天冬酰胺酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高L-天冬酰胺酶分泌表達(dá)的方法，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)在天冬酰胺酶的N端融合pelB信號(hào)肽，使重組菌的胞外天冬酰胺酶酶活提高了20倍，進(jìn)一步共表達(dá)lepB信號(hào)肽酶，可將天冬酰胺酶酶活在此基礎(chǔ)上提高1.45倍。改造后的菌株產(chǎn)酶能力顯著提高，更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。
【IPC分類】C12N9-82, C12N1-21, C12N15-70
【公開(kāi)號(hào)】CN104611317
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510102732
【發(fā)明人】劉松, 阮潔, 馮岳, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 黎清華
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年3月9日