GhGL3基因啟動(dòng)子、載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種GhGL3基因啟動(dòng)子、載體 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是棉花產(chǎn)量和消費(fèi)量最高的國(guó)家之一。棉花原產(chǎn)于亞熱帶，是錦葵科棉花屬 植物的種子纖維。棉花纖維細(xì)胞是由棉花種皮的單細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，經(jīng)歷起始、初生壁合成、 次生壁合成和成熟期四個(gè)時(shí)期。成熟的棉花纖維白色至白中帶黃，長(zhǎng)約2至4厘米，含纖維 素約87-90%。棉花分為粗絨棉、長(zhǎng)絨棉和細(xì)絨棉三種。中國(guó)的細(xì)絨棉占棉花產(chǎn)量的98%， 栽培最為廣泛的陸地棉屬于細(xì)棉絨。因此，棉花種子的表皮毛纖維細(xì)胞，特別是陸地棉不僅 是研宄植物單細(xì)胞發(fā)育及纖維素沉積的良好研宄材料，而且有著極其重要的應(yīng)用價(jià)值。 [0003] 分子遺傳學(xué)證明不同植物的表皮毛發(fā)育具有高度保守性。擬南芥表皮毛是一種特 化的單細(xì)胞表皮結(jié)構(gòu)，廣泛分布于葉片、莖、蓮座葉、花瓣和根上。棉纖維作為一種子房胚珠 外珠被上的單細(xì)胞表皮毛，它的發(fā)育啟動(dòng)機(jī)制類似于擬南芥表皮毛的形成機(jī)制。
[0004] 目前已經(jīng)證明，擬南芥表皮毛和根毛的啟動(dòng)至少是由三個(gè)基因（GL1 (or WER) -GL3 (or EGL3) -TTG1)產(chǎn)物組成的復(fù)合體MYB-bHLH-WD40促進(jìn)GL2和R3類MYB轉(zhuǎn)錄因 子（包括TRIPTYCHON、TRY和CPC)的表達(dá)來(lái)控制。GL2轉(zhuǎn)錄因子會(huì)促進(jìn)下游基因表達(dá)來(lái)達(dá) 到促進(jìn)表皮毛起始發(fā)育，抑制根毛的起始發(fā)育。但此模型也并不排除它們中的每個(gè)單基因 都對(duì)表皮毛的啟動(dòng)有促進(jìn)作用。其中，GLl編碼R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)構(gòu)和功能上相當(dāng) 于WER。GhMYB109是棉花中第一個(gè)克隆到得R2R3類轉(zhuǎn)錄因子，在棉花纖維的起始和伸長(zhǎng)期 表達(dá)，控制著棉花纖維的發(fā)育。TTGl介導(dǎo)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用，為正向的調(diào)控因子。其 中AtGL3(匪148067)和AtEGL3(匪202351)編碼擬南芥轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。 酵母雙雜實(shí)驗(yàn)證明GL3/EGL3在轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中起著橋連作用，與WER、TRY、CPC和TTG都有相 互作用。
[0005] GhGL3 (GhDEL65AF336280)的基因長(zhǎng)度 2513bp，ORF 長(zhǎng)度 1863bp，編碼一個(gè) 620 個(gè) 氨基酸的蛋白（AAK19613. 1)，具有典型的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)。對(duì)擬南芥和棉花的bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行同源性分析，GhGL3和AtEGL3基因的ORF同源性為52. 1%，氨基酸序 列同源性為79. 15% ;GhGL3和AtGL3的基因 ORF序列同源性為61%，氨基酸序列同源性為 49.38 %〇
[0006] 根據(jù)棉花基因組數(shù)據(jù)的分析，GL3在DD基因組雷蒙德氏棉Gossypium raimondii 第4號(hào)染色體的contigl241上，基因長(zhǎng)度為2513bp，包含8個(gè)內(nèi)含子；在AA基因組亞洲棉 的Gossypium arboreum第3號(hào)染色體的contigl205上，基因長(zhǎng)度為2519bp，也包含8個(gè)內(nèi) 含子。經(jīng)過(guò)DNAMAN軟件分析，GrGL3和GaGL3基因的序列一致性達(dá)到97. 61%。Southern blot結(jié)果也顯示GL3在AADD基因組陸地棉Gossypium hirsutum中以雙拷貝形式存在。
[0007] GhGL3和GaGL3的ORF序列同源性為98 %。兩個(gè)基因都編碼620個(gè)氨基酸，其中有 20個(gè)氨基酸的不同，氨基酸序列一致性達(dá)到96. 45 %。用AtGL3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GaGL3 (GaDEL65 JN997400)的表達(dá)可以互補(bǔ)擬南芥突變體gl3-l的表皮毛發(fā)育表型；原位雜交實(shí)驗(yàn)和 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GaGL3主要在棉花的纖維中表達(dá)。酵母雙雜交和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 提示GaGL3與GaMYB23和GaTTGl形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體調(diào)控亞洲棉的纖維發(fā)育。RT-PCR以及 qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)GhGL3只在花期以前、花期和開(kāi)花初期的胚珠中表達(dá)，而在花粉及葉子中 都不表達(dá)，組織原位雜交也同樣發(fā)現(xiàn)該基因在纖維起始期和伸長(zhǎng)期表達(dá)，由此推測(cè)GhGL3 是在胚珠中特異表達(dá)、與棉纖維發(fā)育功能相關(guān)的基因，其啟動(dòng)子可能對(duì)棉花纖維的起始及 伸長(zhǎng)起重要的調(diào)控作用。
[0008] 啟動(dòng)子是基因的表達(dá)調(diào)控元件，決定基因的活動(dòng)和產(chǎn)生哪一種蛋白質(zhì)。目前已知 的棉花纖維特異表達(dá)的啟動(dòng)子GaRDLl啟動(dòng)子（陳曉亞2006)，fdh基因啟動(dòng)子（朱玉賢 2011)和fifl啟動(dòng)子（Chen et al 2009)等得到了克隆。但是對(duì)于控制表皮毛發(fā)育的轉(zhuǎn)錄 因子復(fù)合體MYB-bHLH-WD40,目前已知的第一個(gè)克隆的R2R3類轉(zhuǎn)錄因子GhMYB109的啟動(dòng)子 得到了克隆，并申請(qǐng)了專利，bHLH類基因的啟動(dòng)子還未見(jiàn)報(bào)道。
[0009] 克隆GhGL3基因的啟動(dòng)子不僅能豐富棉花纖維特異/優(yōu)勢(shì)啟動(dòng)子資源，而且有助 于研宄棉花纖維和表皮毛的發(fā)育，也能滿足棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因功能驗(yàn)證和纖維品質(zhì)轉(zhuǎn) 基因育種的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 有鑒于此，本發(fā)明的主要目的之一在于提供一種GhGL3基因啟動(dòng)子、載體及其應(yīng) 用，以獲得棉花、擬南芥等植物花蕾纖維和表皮毛的特異表達(dá)啟動(dòng)子，從而能夠?qū)γ藁?、擬 南芥等植物的培育進(jìn)行優(yōu)選和控制。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，作為本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種GhGL3基因啟動(dòng) 子，其具有如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，或者是將如SEQ ID No. 1或 SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列相同的活性。
[0012] 其中，所述GhGL3基因啟動(dòng)子的核苷酸序列與所述SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列具有75%以上的同源性，或者與所述SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列具有80%以上的同 源性。
[0013] 其中，所述GhGL3基因啟動(dòng)子為在所述啟動(dòng)子的任一片段上具有擴(kuò)增的引物對(duì)的 啟動(dòng)子，以及
[0014] 所述上游引物和下游引物之間的距離在所述GhGL3基因啟動(dòng)子的第1堿基到第 4320個(gè)堿基之間，優(yōu)選在第2313堿基到第4320個(gè)堿基之間，所述引物對(duì)中的每一個(gè)引物的 長(zhǎng)度為15到30個(gè)堿基。
[0015] 以及，含有如上任意一項(xiàng)所述的GhGL3基因啟動(dòng)子的載體。
[0016] 其中，所述載體為 pBIlOL 2-GhGL3 pro ::⑶S0
[0017] 其中，在所述GhGL3基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始后加入了別的基因的編碼序列或增強(qiáng) 子。
[0018] 其中，在所述載體中加入了植物可選擇性標(biāo)記或具有抗性的抗生素標(biāo)記物。
[0019] 其中，所述載體通過(guò)使用基因槍、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、 微注射或電導(dǎo)技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞。
[0020] 以及，含有如上任意一項(xiàng)所述的載體的宿主細(xì)胞。
[0021] 以及，含有如上任意一項(xiàng)所述的GhGL3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
[0022] 其中，所述被轉(zhuǎn)化的植物是單子葉植物或雙子葉植物。
[0023] 其中，所述被轉(zhuǎn)化的植物是棉花或擬南芥。
[0024] 作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，如上任意一項(xiàng)所述的GhGL3基因啟動(dòng)子在培育纖維植 物新品種中的應(yīng)用。
[0025] 其中，所述植物為棉花或者擬南芥。
[0026] 以及，如上任意一項(xiàng)所述的GhGL3基因啟動(dòng)子在植物組織中表達(dá)模式的應(yīng)用。
[0027] 其中，所述植物組織為花蕾纖維和表皮毛。
[0028] 以及，如上任意一項(xiàng)所述的GhGL3基因啟動(dòng)子在棉花纖維和表皮毛的特異表達(dá)上 的應(yīng)用。
[0029] 基于上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明的GhGL3基因啟動(dòng)子具有以下有效效果：（1)本 發(fā)明的啟動(dòng)子可以引導(dǎo)外源基因在棉花等植物中表達(dá)，將獲得使某目的基因在棉花纖維中 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株；(2)在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始后可 加上任何一種基因的編碼序列或任何一種增強(qiáng)子；(3)為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物 進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記或具有抗性的抗 生素標(biāo)記物；(4)攜帶有本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒 載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞，被轉(zhuǎn)化的植物宿主 既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物；(5)當(dāng)本發(fā)明的啟動(dòng)子被用于目的基因在棉 纖維中特異表達(dá)或改變棉花纖維數(shù)量、質(zhì)量性狀時(shí)，可采用以下方法：①將本發(fā)明的啟動(dòng)子 克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中，在其后接上目的基因的編碼序列；②將所構(gòu)建的植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn) 化可再生棉花組織（或器官）并使本發(fā)明啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)化的組織中表達(dá)；③將被轉(zhuǎn)化的組織 (或器官）培養(yǎng)成需要的棉花植株，從而本發(fā)明的GhGL3基因啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)目的基因在棉 纖維和表皮毛中特異表達(dá)，并對(duì)培育纖維植物新品種，特別是培育棉花新品種具有重要意 義。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明的GhGL3啟動(dòng)子與⑶S基因的融合表達(dá)載體圖譜和轉(zhuǎn)基因植株鑒 定；
[0031] 圖2是本發(fā)明的GhGL3啟動(dòng)子：:⑶S基因在棉纖維起始期至伸長(zhǎng)期（-1DPA-5DPA) 的表型照片；
[0032] 圖3是本發(fā)明的GhGL3啟動(dòng)子：：⑶S基因在棉花葉片上的表型照片；
[0033] 圖4是本發(fā)明的GhGL3啟動(dòng)子：：GUS基因在棉花植株花器官上的表型照片；
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