斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10基因及其編碼的蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開(kāi)了斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10基因及其編碼的蛋白，屬于生物基因技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs)又稱(chēng)應(yīng)激蛋白，是機(jī)體細(xì)胞在一些應(yīng)激 原（如環(huán)境高溫、缺氧、重金屬中毒、氧化應(yīng)激、感染、饑餓、創(chuàng)傷、代謝毒物等）的誘導(dǎo)下，使 HSP基因被激活，且高效表達(dá)的一組在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，對(duì)機(jī)體免受應(yīng)激因素的損 害具有重要作用。
[0003] HSPlO是小分子質(zhì)量HSP家族的重要一員，它作為一種分子伴侶蛋白時(shí)，與HSP60 一端或兩端連接，擴(kuò)大HSP60分子內(nèi)腔對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行初步折疊。HSPlO也有促進(jìn)細(xì)胞增殖、 抑制凋亡的作用，2010年He等人研宄表明HSPlO具有抑制生殖細(xì)胞凋亡的作用。高表達(dá) HSPlO可抑制生殖細(xì)胞凋亡；HSPlO在細(xì)胞受到高溫、紫外線(xiàn)、藥物、缺氧等刺激下大量表 達(dá)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞作用。在生殖方 面，HSPlO參與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，進(jìn)而可能影響卵泡及卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟；2008 年Walsh等人發(fā)現(xiàn)HSPlO通過(guò)直接組裝精子表面的透明帶受體復(fù)合物，參與精子與透明帶 的識(shí)別過(guò)程，進(jìn)而影響精子與卵母細(xì)胞的受精過(guò)程。此外，HSPlO還參與炎癥、免疫過(guò)程以 及生殖相關(guān)。
[0004] 近年來(lái)隨著生態(tài)環(huán)境的惡化，水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)受到了嚴(yán)重的影響，而水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)環(huán) 境的穩(wěn)定性要求相對(duì)較高，特別是斑節(jié)對(duì)蝦的繁育與養(yǎng)殖。因此，為了繁育出高抗逆性?xún)?yōu)良 品質(zhì)的斑節(jié)對(duì)蝦，對(duì)其生長(zhǎng)、生死、免疫相關(guān)分子機(jī)理的研宄顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于以實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè) 計(jì)的PCR擴(kuò)增引物，并通過(guò)RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10基因的全表達(dá)序列；該 序列不僅為研宄斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10在斑節(jié)對(duì)蝦中的作用奠定基礎(chǔ)，而且可以為斑節(jié) 對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中所出現(xiàn)的對(duì)各種理化刺激應(yīng)答效應(yīng)從分子層面提供理論基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明提供的熱休克蛋白10基因，該基因序列如SEQ ID NO: 1所不。
[0007] 該基因的制備方法依次包括下述步驟：
[0008] 1、總RNA的提取
[0009] 取健康斑節(jié)對(duì)奸，解剖，取卵巢組織，并將組織于ImL Trizol (Invitrogen，日本） 中勻漿，按Trizol試劑盒使用手冊(cè)提取斑節(jié)對(duì)蝦總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀(guān)察所提 取RNA的完整性，并置于-80 °C保存。
[0010] 2、CDNA第一鏈的合成
[0011] 取上述斑節(jié)對(duì)蝦總1?隱2以1^與反轉(zhuǎn)錄引物（〇1丨8〇-(117^(^口丨〇1'(5'-660^06〇6八 CTAGTAC(T) 16-3' ) 1 μ L(IOpmoVL)混合在反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成 cDNA-鏈，反應(yīng)條件：42°C 60min，70°C 15min。
[0012] 3、引物設(shè)計(jì)依據(jù)，引物合成的方法
[0013] 根據(jù)已有的斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10的EST序列設(shè)計(jì)引物：
[0014] Pm-HSPlOcDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增及表達(dá)所用的引物
[0015]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3. 含權(quán)利要求1或2所述基因的重組載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為將權(quán)利要求1或2所 述基因插入pET21a質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
5. 含有權(quán)利要求1或2所述基因的重組菌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是將權(quán)利要求4所述重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21得到的。
7. 權(quán)利1或2所述的斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10在大腸桿菌中體外重組表達(dá)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了斑節(jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10基因及其編碼的蛋白，該基因?yàn)檠芯堪吖?jié)對(duì)蝦熱休克蛋白10在斑節(jié)對(duì)蝦中的作用奠定基礎(chǔ)，而且可以為斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中所出現(xiàn)的對(duì)各種理化刺激應(yīng)答效應(yīng)從分子層面提供理論基礎(chǔ)；其技術(shù)要點(diǎn)，該基因序列如SEQ ID NO:1所示；編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域。
【IPC分類(lèi)】C12N1-21, C12N15-70, C07K14-435, C12N15-12
【公開(kāi)號(hào)】CN104611341
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510082559
【發(fā)明人】邱麗華, 傅明駿, 趙超, 史進(jìn)選, 江世貴, 周發(fā)林
【申請(qǐng)人】中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
【公開(kāi)日】2015年5月13日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日