0038] 實(shí)例3AaBDHl全長cDNA的克隆
[0039] 根據(jù)已獲得保守區(qū)片斷的序列設(shè)計(jì)5' -RACE引物：5' -CCTTCGTGCTGCAGGTTCTTCTC -3'（SEQIDNo·3);3'-RACE引物：5'-GATCTGTTTCGCAATGATATTTTG-3'（SEQIDNo·4)。對獲 得的5'和3' RACE PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果如圖2所示，AaBDHl基因的5' -和3' -RACE PCR產(chǎn)物總長度分別約為950bp和960bp。5'和3' RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入T/A載 體并測序，測序結(jié)果表明5'和3'RACE序列長度分別為950bp和960bp。將測序得到的3' 端和5'端核苷酸序列通過中間重疊區(qū)進(jìn)行拼接，得到長為1415p的如SEQ ID No. 1所示的 AaBDHl基因 cDNA全長序列。通過NCBI數(shù)據(jù)庫及DNAStar軟件對所得到的AaBDHl全長cDNA 序列進(jìn)行ORF的分析和氨基酸的預(yù)測。結(jié)果顯示AaBDHl基因 cDNA的最大ORF從第316堿 基開始，到第1200堿基終止，885個(gè)堿基共編碼294核苷酸。由該基因編碼的冰片脫氫酶的 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。該蛋白的AaBDHl氨基酸殘基數(shù)294,分子量31043. 4Da， 理論等電點(diǎn)PI 6. 16,含量較豐富的氨基酸：Val (36個(gè)，12. 3% )、Gly (30個(gè)，占10. 2% )、 Ala(24f、8.2%)、Leu(24f、8.2%)、Ser(22f，&7.5%)、Asn(2lf，&7.1%)、Thr(18 個(gè)，占6. 1% )，含量比較少的氨基酸是Gln (4個(gè)，占1.4% )和Met (5個(gè)，占1.7% )，而不 含Trp、Pyl和See。帶負(fù)電荷的氨基酸數(shù)（Asp+Glu)為28,帶正電荷的氨基酸數(shù)（Arg+Lys) 為25,分子式為C1370H2196N3740424S11原子總數(shù)為4375,其半衰期在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織 紅細(xì)胞內(nèi)為30h，在酵母細(xì)胞內(nèi)大于20h，在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)大于10h，不穩(wěn)定系數(shù)為15. 6， 表明該蛋白穩(wěn)定性好。脂肪系數(shù)為98. 06，Grand average of hydropahicity(GRAVY)親水 性評估為-0. 142。
[0040] 將AaBDHl基因的氨基酸序列與GenBank中其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對（見 圖3)。結(jié)果表明，該基因編碼的氨基酸序列與西紅柿（Solanum Iycopersicum)花姜酮合 成酶 S1ZBS(XP_004249781.1)相似性為 70%，毛果楊（Populus trichocarpa)乙醇脫氫酶 PtADH(EEE92928. 1)相似性為 69%，川桑（Morus notabili)稻內(nèi)酯酶MnMLAS(EXC01949. 1) 相似性為68 %，與麻（Ricinus communis)短鏈醇脫氫酶RcSAD (EEF32231. 1)70 %的相似 性。實(shí)施例4冰片脫氫酶基因 AaBDHl的異源表達(dá)
[0041] 一、攜帶黃花蒿冰片脫氫酶基因 AaBDHl的重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0042] 以黃花蒿cDNA為模板，根據(jù)序列SEQ ID No. 1設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增黃花蒿冰片脫 氫酶基因編碼區(qū)的脫氧核糖核苷酸序列。引物兩端分別引入BamHI和Xho I酶切位點(diǎn)，弓丨 物序列如下：
[0043] 上游：5' -CCGGAATTCATGAACGGTGTATATCCCCAC-3'（SEQ ID No. 5)，引入 EcroI 酶切 位點(diǎn)，
[0044] 下游：5'-CCGCTCGAGTTATGTTGCATGACTTACACCG-3'（SEQIDNo·6)，引入XhoI酶切 位點(diǎn)。
[0045] 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（如圖4)，切下目的條帶純化回收，將回收 的DNA片段連接到pGEM-T easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Esherichia coli)DH5a感受態(tài)細(xì) 胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒測序，得到含有BamHI和Xho I酶切位點(diǎn)及編碼黃花 蒿冰片脫氫酶的脫氧核糖核苷酸序列的質(zhì)粒PGEMT-AaBDHl。
[0046] 將質(zhì)粒pGEMT-AaBDHl和質(zhì)粒pET28a (+)先在30°C條件下分別用雙酶切2h后再在 37°C條件下分別用雙酶切2h，酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收，用T4DNA 連接酶4°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取Kan抗性平板上長出的單克隆， 提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切圖譜鑒定，結(jié)果如圖5所示，可知重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將 獲得的重組表達(dá)載體命名為pET28a (+) -AaBDHl。
[0047] 二、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主、陽性克隆鑒定
[0048] 將步驟一中構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET28-AaBDHl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài) 細(xì)胞，挑取Kan抗性平板上長出的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。以AaBDHl基因重組表達(dá)載體的單 克隆菌落為模板，用M13F和M13R引物進(jìn)行PCR檢測。菌落PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖5,可 知單克隆菌落含有目的基因片段，可用于蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
[0049] 三、AaBDHl基因的原核表達(dá)
[0050] 將步驟二中鑒定正確的克隆培養(yǎng)過夜，再將細(xì)菌100倍稀釋于含Kan(50mg/L)的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液生長至0D600為0. 6-0. 8時(shí)，加入IPTG (終濃度為0. 3mmol/L)進(jìn)行 誘導(dǎo)培養(yǎng)，28°C誘導(dǎo)6h。取誘導(dǎo)過的菌液250ml離心IOmin,離心收集菌體（4000rpm，IOmin, 4°C)，用 50mL Binding buffer (20mM Tris-Cl，500mM NaCl，and IOmM imidazole, pH 7.9) 洗漆菌體2遍后，重懸于30mL IXbinding buffer中，進(jìn)行超聲波破碎以釋放蛋白，然后 高速冷凍低溫離心（12000x g，30min，4°C )除去不溶部分。取稍許上清和沉淀樣品KKTC 煮沸，離心后（12000x g，20min，4°C )，將上清部分上樣到鎳柱HisTrap HT column(lmL, GE Healthcare)上，待濾液全部過濾完后，用 wash buffer(20mM Tris-Cl, pH 7.9, 500mM NaCl, 50mM imidazole)沖洗兩次，每次 3mL。然后用 2. 5ml elution buffer (20mM Tris_Cl，pH 7.9, 500mM NaCl,250mM imidazole)洗脫。用 Vivaspin(20mL，10kD)濃縮至 2. 5mL，經(jīng)ro-10脫鹽柱（GE Healthcare)脫鹽后，溶解于含10%甘油的Tris-HCl緩沖液 (50mM，ρΗ8· 0)，米用Bradford方法測定蛋白濃度后（Bradford et al.，1976)，分裝保存 于-80°C備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)檢測重組蛋白，結(jié)果見圖6,表達(dá)蛋白的分 子量約為32Kda。
[0051] 四、AaBDHl酶促反應(yīng)及其產(chǎn)物檢測
[0052] 取I. 5mL的離心管，加入10 μ L純化后的AaBDHl重組蛋白溶液，加入50mM磷酸鹽 緩沖液，pH 7. 5,加入NADP+或NAD+到終濃度為0,1mM，加入0,1mM冰片，30°C孵育3h。反 應(yīng)后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，蒸干后用甲醇溶解，然后利用GC進(jìn)行分析，分析條件為：FID檢 測器，HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（30mX0. 32mmX0. 25μπι)，高純氮?dú)猓?9. 999%)為載氣，流 速2mL/min，高純氮?dú)?0mL/min尾吹，進(jìn)樣口溫度235 °C，檢測器溫度285 °C，分流比3:1，進(jìn) 樣量1 μ L，外標(biāo)法定量。柱升溫程序：初始溫度40°C，保持5min，以0. 8°C /min升至200°C 后，保持25min。結(jié)果表明（見圖7)，無論在輔酶NAD+或NADP+存在下，AaBDHl均能轉(zhuǎn)化 2_茨醇為樟腦，但在NAD+存在的條件下AaBDHl的酶活性較在NADP+存在的條件下要強(qiáng)。 而對照組中（添加煮沸過的AaBDHl酶），無論在輔酶NAD+或NADP+存在下，均未檢測到樟 腦。說明該酶能氧化2-茨醇，從而驗(yàn)證了 AaBDHl為2-茨醇脫氫酶。
[0053] 文中所用引物：
[0054]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黃花蒿冰片脫氫酶基因AaBDHl，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述黃花蒿冰片脫氫酶基因AaBDHl編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
3. 含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
4. 如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，該載體為重組表達(dá)載體 pET28a(+)_AaBDHl 和基因沉默載體 pHellsgate8_AaBDHl。
5. 含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)基因黃花蒿或組織。
6. 含有權(quán)利要求1所述基因的宿主菌。
7. 權(quán)利要求1所述的黃花蒿冰片脫氫酶基因AaBDHl在催化冰片生成樟腦中的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求2所述的黃花蒿冰片脫氫酶基因AaBDHl的編碼蛋白在催化冰片生成樟腦 中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的黃花蒿冰片脫氫酶基因AaBDHl在調(diào)控黃花蒿體內(nèi)冰片與樟腦的 比例中的應(yīng)用。
10. -種體外表達(dá)黃花蒿冰片脫氫酶AaBDHl的方法，其特征在于，該方法是利用重組 表達(dá)載體，將權(quán)利要求1所述的基因?qū)胨拗骶校T導(dǎo)該基因表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種黃花蒿冰片脫氫酶基因AaBDH1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。黃花蒿冰片脫氫酶AaBDH1能夠催化冰片形成樟腦，為體外催化冰片生成樟腦，以及黃花蒿體內(nèi)調(diào)控香精油組分的組成提供了一種新的可選擇途徑。此外，本發(fā)明通過原核表達(dá)制備重組AaBDH1，克服了直接從黃花蒿中分離該蛋白的困難，降低了成本。
【IPC分類】C12N15-53, A01H5-00, C12N9-02, C12P7-26, C12N15-82
【公開號】CN104611347
【申請?zhí)枴緾N201510020391
【發(fā)明人】劉碩謙, 崔宇倩, 商婷婷, 楊威, 田冬銘, 陳蓓
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月15日