基于signal-off的表面增強拉曼技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于signal-off的表面增強拉曼技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是目前危及人類健康的主要兇手之一，治療癌癥的最佳辦法是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。因此，開發(fā)新型、靈敏、特異性的早期診斷探針意義重大。
[0003]目前，癌癥的臨床診斷方法主要基于影像學(xué)檢查組織和細(xì)胞形態(tài)，其分辨率較低，缺乏明確統(tǒng)一的標(biāo)識分子等問題，難以實現(xiàn)癌癥的早期診斷。如何尋找一種真正能夠早期發(fā)現(xiàn)腫瘤并將其消滅于萌芽狀態(tài)的方法，顯得尤其迫切?，F(xiàn)在臨床上主要是依靠腫瘤標(biāo)志物來進(jìn)行癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和診斷的。其中，端粒酶被認(rèn)為是一種很有前景的腫瘤標(biāo)志物。
[0004]近年來，表面增強拉曼散射(surfaceenhanced Raman scattering, SERS)技術(shù)作為一種強有力的分析工具引起了人們的廣泛關(guān)注，原因在于結(jié)構(gòu)信息更豐富、光譜采集速度快、可避免多種物質(zhì)間的相互干擾、信噪比高、靈敏度可達(dá)單分子水平、檢測條件溫和、對樣品無接觸、無損傷等。作為檢測腫瘤標(biāo)志物的一種重要分析方法，SERS檢測技術(shù)將為腫瘤的早期診斷以及預(yù)后的監(jiān)測起到更為重要的作用。但是，目前所采用的SERS檢測方法大都基于signal-on的模式，對于signal-off模式的SERS檢測腫瘤標(biāo)志物的方法目前文獻(xiàn)報道的較少。因此，制備基于signal-off的SERS檢測探針，建立高靈敏、高特異性的SERS腫瘤標(biāo)志物的檢測方法，能夠有效解決癌癥早期診斷這一臨床迫切需要解決的實際問題，具有很大的發(fā)展空間。
[0005]該專利制備的納米探針為端粒酶響應(yīng)的拉曼“開-關(guān)”結(jié)構(gòu)，只有在端粒酶的作用下才會發(fā)生拉曼信號減弱或淬滅現(xiàn)象，實現(xiàn)細(xì)胞端粒酶活性檢測。通過比較不同細(xì)胞內(nèi)拉曼信號的強弱，可區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，利用藥物作用后細(xì)胞內(nèi)拉曼信號的變化，可實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性對藥物響應(yīng)的動態(tài)檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是:以石墨烯、氮化碳、MoS2, S12等為載體，在其上負(fù)載尺寸形貌可控的納米金、納米銀或具有核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性納米粒子，然后將包含端粒酶引物和拉曼分子信標(biāo)的發(fā)夾探針固定在納米粒子表面，建立基于signal-off的高靈敏、高選擇性的SERS檢測方法。當(dāng)有靶存在時，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重復(fù)序列的DNA鏈，與探針分子雜交，DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，其末端單鏈標(biāo)記的拉曼信號分子遠(yuǎn)離拉曼基底，此時拉曼信號降低，實現(xiàn)端粒酶的高靈敏檢測。以Hela宮頸癌細(xì)胞為模型，制備的探針實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的檢測，以及端粒酶抑制藥物作用后細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性變化的動態(tài)監(jiān)測。通過對多種細(xì)胞進(jìn)行成像，證實探針可用于區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明提出的可對細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性進(jìn)行檢測的納米探針如圖1所示。以石墨稀、氮化碳、MoS2> 3;102等為載體，在其上負(fù)載尺寸形貌可控的納米金、納米銀或具有核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性納米粒子，然后將包含端粒酶引物和拉曼分子的分子信標(biāo)的發(fā)夾探針固定在納米粒子上面。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
I)基底包含兩部分:一是載體，另一個是納米粒子。納米粒子可以通過表面原位生長或者浸漬等方法負(fù)載于載體表面。
[0009]2)探針通過巰基、氨基或者羧基等修飾固定在納米金、納米銀、具有核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性納米粒子的表面。
[0010]本發(fā)明的工作原理:
本發(fā)明的工作原理如圖1所示，標(biāo)記有羅丹明6G的納米探針，在沒有端粒酶存在時，由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的存在，羅丹明6G靠近納米粒子表面，拉曼信號被大大的增強。將探針與細(xì)胞共同孵育，探針進(jìn)入細(xì)胞后，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重復(fù)序列的DNA鏈，與探針分子雜交，DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，釋放出末端單鏈，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，其末端單鏈標(biāo)記的拉曼信號分子遠(yuǎn)離拉曼基底，此時拉曼信號降低，實現(xiàn)端粒酶的高靈敏檢測，區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。亦可利用所述的納米探針對端粒酶抑制藥物作用后的細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性檢測，分析藥物對細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的影響并對其進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。
【附圖說明】
[0011]圖1納米探針對細(xì)胞內(nèi)端粒酶原位成像檢測的原理圖。
[0012]圖2腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞拉曼對比圖。
實施例
[0013]以下為實施本發(fā)明的具體示例，其作用在于進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，使閱讀者更容易理解，但不構(gòu)成對本發(fā)明要求的保護(hù)范圍的限定或限制。
[0014]實施例一結(jié)合圖1，合成可對細(xì)胞內(nèi)端粒酶檢測的納米探針。
[0015]將20 μ L發(fā)夾DNA (150 μ M)和20 μ L端粒酶引物(150 μ Μ)與2mL載體負(fù)載的納米粒子混合后，室溫下攪拌20h。然后將0.2mL含有IM NaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.8)逐滴加入到上述混合液中穩(wěn)定納米探針。將上述溶液離心并用PBS洗滌后，重新分散在ImLPBS中，得到納米探針，于4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0016]實施例二結(jié)合圖2，利用納米探針進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的活性檢測。
[0017]將HeLa細(xì)胞與探針共同孵育2h，利用激光共焦拉曼光譜儀進(jìn)行觀察。在端粒酶陽性的HeLa細(xì)胞中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探針被打開，拉曼信號減弱，可區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。將端粒酶抑制藥物兒茶素與HeLa細(xì)胞共同孵育48h，然后加入20 μ L探針并溫育2h，用拉曼光譜儀觀察，可看到細(xì)胞內(nèi)拉曼信號遠(yuǎn)高于腫瘤細(xì)胞的信號，說明細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性受到藥物的抑制。
【主權(quán)項】
1.一種可對細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性進(jìn)行檢測的納米探針，其特征為以石墨烯、氮化碳、皿052、3;102等為載體，在其上負(fù)載尺寸形貌可控的納米金、納米銀、具有核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性納米粒子；納米粒子可以通過表面原位生長或者浸漬等方法負(fù)載于載體表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米探針，其特征在于可特異性響應(yīng)端粒酶，對細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性實現(xiàn)“開-關(guān)”可控的檢測，可以區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，并動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性在端粒酶抑制藥物作用下的變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的納米探針，其特征在于所用發(fā)夾探針，其上面3’端可修飾巰基、氨基或者羧基等(M)，5’端修飾羅丹明6G (R6G)，其發(fā)夾的環(huán)狀部分可以識別端粒酶引物，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重復(fù)序列的DNA鏈，與探針分子雜交，DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，釋放出末端單鏈；所述的核苷酸序列為:探針序列:5’ -R6G-ACG TAG TCC GCTTTA AAC TCT GCT CG A CGG TAA AGC GGA CTA CGT - M -3’ ；端粒酶引物:5，- AAT CCGTCG AGC AGA GTT-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的納米探針，其特征在于其熒光“開-關(guān)”的轉(zhuǎn)換是通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)的閉合打開來實現(xiàn)的；當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)為環(huán)狀關(guān)閉結(jié)構(gòu)時，羅丹明6G的拉曼信號被大大增強；當(dāng)環(huán)被打開時，羅丹明6G遠(yuǎn)離納米粒子表面，拉曼信號減弱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的納米探針，其特征在于探針進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)端粒酶的作用下，引物延伸出具有重復(fù)序列的DNA鏈，與探針分子雜交，DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，釋放出末端單鏈，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，其末端單鏈標(biāo)記的拉曼信號分子遠(yuǎn)離拉曼基底，此時拉曼信號降低，實現(xiàn)端粒酶的高靈敏檢測，從而區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于signal-off的表面增強拉曼技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性。本發(fā)明以石墨烯、氮化碳、MoS2、SiO2等為載體，在其上負(fù)載尺寸形貌可控的納米金、納米銀或具有核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合磁性納米粒子，然后將包含端粒酶引物和拉曼分子信標(biāo)的發(fā)夾探針固定在納米粒子表面，建立基于signal-off的高靈敏、高選擇性的SERS檢測方法。當(dāng)有靶存在時，在端粒酶的作用下引物延伸出具有重復(fù)序列的DNA鏈，與探針分子雜交，DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，其末端單鏈標(biāo)記的拉曼信號分子遠(yuǎn)離拉曼基底，此時拉曼信號降低，實現(xiàn)端粒酶的高靈敏檢測。以Hela宮頸癌細(xì)胞為模型，制備的探針實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的檢測，以及端粒酶抑制藥物作用后細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性變化的動態(tài)監(jiān)測。通過對多種細(xì)胞進(jìn)行成像，證實探針可用于區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104611416
【申請?zhí)枴緾N201410744834
【發(fā)明人】孫召梅, 修寶, 郭英姝, 張書圣
【申請人】臨沂大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月9日