一種三疣梭子蟹線粒體基因組甲基化位點標記檢測技術的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明涉及到一種三疣梭子蟹線粒體基因組甲基化位點標記檢測技術，可以應用 于三疣梭子蟹種質鑒定、增殖放流標記等領域，是一種線粒體DNA分子標記技術。
【背景技術】：
[0002] DNA甲基化屬于表觀遺傳學的范疇，是指生物體在不改變DNA序列的情況下，通過 對DNA序列中胞嘧啶的甲基化來調控基因表達的一種遺傳調控方式。DNA甲基化主要是指 在甲基轉移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基（CH 3)，形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC)或少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA)及7-甲基鳥嘌呤（7-mG)，通過這 種修飾作用可引起染色質的結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改 變，進而導致被甲基化的生物基因失去活性，從而起到調控基因沉默或開啟的作用。甲基化 后的DNA序列雖然很多情況下可以逆轉，即去甲基化而恢復原狀，但也可以遺傳給子代，具 有一定的物種和個體特異的遺傳性，因此也可以用來作為分子標記對同一物種不同群體和 個體進行識別和鑒定。而線粒體基因組中的甲基化標記，由于具有母性遺傳的特點，即可以 通過母親遺傳給子代，而與父親無關，因此在種質鑒定和增殖放流標記等方面具有更好的 應用前景。
[0003] 目前DNA甲基化分析的方法和技術很多，針對于全基因組水平的分析方法有化學 發(fā)光定量檢測技術、基于DNA甲基化分析的微陣列技術、甲基免疫共沉淀、高效液相色譜 分析技術等；針對于特定基因或序列區(qū)位點的分析方法有甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)、結合亞硫酸鹽限制性分析（combined bisulfite restriction analysis，COBRA)、基于Sanger法的重亞硫酸氫鹽測序（BSP)、焦磷酸測序技術等。其中的 重亞硫酸氫鹽測序（BSP)法是操作相對簡單、結果最準確和直接的一種DNA甲基化特定位 點分析方法，此方法可以運用的前提是獲得適合于特點甲基化位點分析的PCR(Polymerase Chain Reaction)擴增引物。獲得該特定引物序列后，就可以通過檢測該引物擴增區(qū)的甲基 化特征，建立相應物種及其個體的分子標記技術。目前，三疣梭子蟹等甲殼類生物中還未 見相關甲基化位點標記的研宄報道。
[0004] 三疣梭子蟹是一類廣泛分布于太平洋和印度洋海域的梭子蟹，也是我國一種重要 的捕撈和養(yǎng)殖經濟蟹類。由于該蟹的特殊生活史特點，即需要多次脫殼才能生長，使用外部 標記或金屬線碼標記等物理標記技術都存在著丟失或者因阻礙三疣梭子蟹生長發(fā)育而降 低存活率的問題，相應的也會使回捕率這一數值很難精確統(tǒng)計，因此需要開發(fā)避開這些問 題的新標志技術；分子遺傳標志技術則是其中的一個首選目標，而線粒體基因組中的分子 標記又是所有分子遺傳標志中最適宜增殖放流標志的工具，因此大力開發(fā)包括甲基化位點 標記技術在內的線粒體分子標記技術是十分必要的，應用前景廣闊。

【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明描述了一種三疣梭子蟹線粒體基因組甲基化位點標記的檢測技術，為三疣 梭子蟹種質鑒定和增殖放流評估提供了一個新的標記技術，主要內容為通過提取三疣梭子 蟹線粒體基因組DNA，利用重亞硫酸氫鹽處理提取的線粒體基因組DNA，在此基礎上設計適 合于甲基化位點擴增的PCR引物，利用該引物通過PCR方法擴增重亞硫酸氫鹽處理過的線 粒體基因組DNA，對PCR擴增產物進行測序，并在測序產物中尋找甲基化位點，以此獲得擴 增產物含有甲基化位點的甲基化特異性擴增引物，進而建立一個適合于三疣梭子蟹種質鑒 定和增殖放流標記操作的甲基化位點標記檢測技術。
【附圖說明】：
[0006] 附圖是甲基化特征圖。圖中顯示的數字"（14902)"表示該序列所在的三疣梭 子蟹線粒體基因組的序列起點為第14902bp處，圖中顯示的數字"（15120)"表示該序列 所在的三疣梭子蟹線粒體基因組的序列終點為第15120bp處，序列全長為219bp ;圖中 " GATTTGGAGCATGGCTTGGCCTAGA "表示本專利申請的甲基化引物序列所對應的原始序列中的 上游引物序列（5'端序列），圖中"GCTTTCACTCCTTCTAAAACTAGGTGCTG"表示本專利申請的 甲基化引物序列所對應的原始序列中的下游引物序列（3'端序列）；圖中凡是被"框"起來 的序列，如|5??1、M?等，表示該序列中的胞嘧啶C為該序列中發(fā)生甲基化的位點。
【具體實施方式】：
[0007] 本發(fā)明可以通過以下幾個操作步驟實現(xiàn)：
[0008] -、線粒體提取
[0009] 采用線粒體提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，產品編號SM0020-50)提取三 疣梭子蟹的線粒體，具體操作步驟如下：
[0010] (1)樣本處理：稱取100_200mg三疣梭子蟹附肢中的肌肉組織，用剪刀剪碎，放入 玻璃勾衆(zhòng)器內，然后加入2. Oml冰預冷的Lysis Buffer，0°C冰浴中上下研磨20次。
[0011] (2)將組織勻漿液轉移到I. 5ml離心管中，在4°C下，IOOOg離心5min。
[0012] (3)離心結束后，取上清并把上清液轉移至新的1.5ml離心管中，在4°C下，IOOOg 再次離心5min。
[0013] (4)離心結束后，取上清并把上清液轉移至新的I. 5ml離心管中，在4°C下，12000g 再次離心IOmin。
[0014] (5)離心結束后，去上清，離心管底部沉淀為線粒體。
[0015] (6)在線粒體沉淀中加入0· 5mlWash Buffer重懸線粒體沉淀；在4°C下，IOOOg離 心 5min〇
[0016] (7)離心結束后，取上清，并把上清液轉移至新的1.5ml離心管中；在4°C下， 12000g離心IOmin ;離心結束后，棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底。
[0017] (8)用50-100ul Store Buffer重懸浮線粒體沉淀，立即使用或-70°C保存。
[0018] 二、線粒體基因組DNA的提取
[0019] 獲得三疣梭子蟹線粒體后，通過如下操作步驟提取其中的線粒體基因組DNA :
[0020] (1)蛋白酶k消化：在上述步驟（8)中獲得的線粒體溶液中加入13 μ 110% SDS溶 液和4 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)，反復倒置10次，用封口膜封住管口，在55°C水浴鍋中水浴 l_3h，水浴期間，輕輕搖勻幾次，直到溶液變?yōu)榍宄和噶痢?br>[0021] (2)從水浴鍋中取出上述溶液，去除封口膜，冷卻至室溫后，在1.5ml離心管中加 入250 μ 1飽和酷，上