鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主范圍 廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花丼等100多種植物枯萎病的發(fā)生。盡管尖孢鐮 刀菌在整體上具有廣泛的寄主范圍，但單個(gè)菌株僅能侵染一種或少數(shù)幾種植物種類。在不 同的寄主上又分為不同的生理?；停壳耙褕?bào)道的生理?；陀?50多種，有些?；?依據(jù)對(duì)不同品種的特異性被進(jìn)一步劃分為不同的生理小種，大多數(shù)?；桶?個(gè)或更多 的生理小種，而一小部分是單型。某生理專化型可能在特定的植物種類上引起病害，但是屬 于其他?；偷木陮?duì)同樣的這種特定植物種類可能無(wú)害甚至對(duì)其有利。
[0003] 香蕉枯萎病，又稱香蕉鐮刀菌枯萎病、巴拿馬病、黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴專 化型（Fusarium oxyporum f.sp.Cubense，F(xiàn)oc)引起的破壞植株維管束而導(dǎo)致植株死亡的 一種毀滅性病害，目前，除地中海、印度洋、南太平洋一些島嶼國(guó)家外，幾乎所有香蕉種植區(qū) 均有遭受該病害危害的報(bào)導(dǎo)。依據(jù)尖孢鐮刀菌古巴?；停‵oc)對(duì)不同品種香蕉的侵染 特異性將其劃分為4個(gè)生理小種（race):其中1號(hào)生理小種（Focl)侵染"大蜜哈" [Gros michel (AAA) ]、Silk (AAB)、Taiwan Latundan (AAB)、IC2 (AAAA)和粉蕉（ABB) ;2 號(hào)生理小種 (Foc2)只侵染雜種三倍體Bluggoe及ABB基因型的相關(guān)煮食蕉類；3號(hào)生理小種侵染野生 揭尾蕉屬（Heliconia spp.)而不是香蕉類，因而被劃分出Foc ;4號(hào)生理小種（Foc4)則侵 染所有的Cavendish類香蕉（AAA)及其他對(duì)1號(hào)與2號(hào)生理小種敏感的蕉類?；贔oc4是 否能在熱帶環(huán)境條件下對(duì)Cavendish類香蕉致病，又將Foc4進(jìn)一步劃分為"尖孢鐮刀菌古 巴專化型熱帶4號(hào)生理小種"(TR4)與"尖孢鐮刀菌古巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小種"(ST4)， 尖孢鐮刀菌古巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小種僅在亞熱帶條件下侵染Cavendish類香蕉。我 國(guó)廣東、廣西、福建、海南、云南和臺(tái)灣地區(qū)等主要香蕉種植區(qū)也均已發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病，且香 蕉枯萎病的發(fā)病加重趨勢(shì)明顯。目前急需一套快速鑒定香蕉是否感染香蕉枯萎病菌的方 法，為生產(chǎn)安全健康香蕉種苗保駕護(hù)航。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定香蕉枯萎病菌中的尖孢鐮刀菌古巴專化 型、尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種和/或尖孢鐮刀菌古巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小 種。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物， 其名稱為成套引物1。
[0006] 本發(fā)明所提供的成套引物1，由名稱為A的PCR引物對(duì)、名稱為B的PCR引物對(duì)和 名稱為C的PCR引物對(duì)組成；
[0007] 所述A由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成；所述 B由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的兩條單鏈DNA組成；所述C由序列表中 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的兩條單鏈DNA組成。
[0008] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是如何鑒定香蕉枯萎病菌中的尖孢鐮刀菌古 巴?；?號(hào)生理小種和/或尖孢鐮刀菌古巴專化型亞熱帶4號(hào)生理小種。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物， 其名稱為成套引物2。
[0010] 本發(fā)明所提供的成套引物2,由所述A和所述C組成。
[0011] 本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問題是如何鑒定香蕉枯萎病菌中的尖孢鐮刀菌古 巴專化型和/或尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種。
[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物， 其名稱為成套引物3。
[0013] 本發(fā)明所提供的成套引物3,由所述B和所述C組成。
[0014] 本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是如何鑒定香蕉枯萎病菌中的尖孢鐮刀菌古 巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小種。
[0015] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的PCR引物 對(duì)。
[0016] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的PCR引物對(duì)，為所述C。
[0017] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)。
[0018] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)為下述Hh-Kk中的任一種：
[0019] Hh、含有所述成套引物1的系統(tǒng)；
[0020] Ii、含有所述成套引物2的系統(tǒng)；
[0021] Jj、含有所述成套引物3的系統(tǒng)；
[0022] Kk、含有所述C的系統(tǒng)。
[0023] 上述鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)，可包括通過PCR鑒定或輔助鑒定香蕉 枯萎病菌所需的試劑和儀器。具體來說，鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)可包括所述 成套引物1、所述成套引物2、所述成套引物3或所述C以及PCR所需要的其它試劑和儀器。
[0024] 上述鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)還可僅包括所述成套引物1、所述成套 引物2、所述成套引物3或所述C。
[0025] 所述成套引物1、所述成套引物2和所述成套引物3中的各引物對(duì)以及PCR所需要 的其它試劑均可獨(dú)立包裝。所述C以及PCR所需要的其它試劑均可獨(dú)立包裝。
[0026] PCR所需要的其它試劑可包括DNA聚合酶（DNA Polymerase)和/或10 XPCR buffer和/或dNTPs。PCR所需要的儀器可為PCR儀。
[0027] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的方法。
[0028] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的方法為下述H-K中的任一種：
[0029] H 下述 Hl)或 H2):
[0030] Hl)下述 H11)和 H12):
[0031] H11)以待測(cè)生物樣品的核酸（DNA或RNA或以RNA為模板轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)為模 板，用所述A進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物Al ;以所述待測(cè)生物樣品的RNA或以RNA為模板轉(zhuǎn) 錄得到的cDNA為模板，用所述B進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物Bl ;以所述待測(cè)生物樣品的核 酸（DNA或RNA或以RNA為模板轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)為模板，用所述C進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR 產(chǎn)物Cl ;
[0032] H12)檢測(cè)H11)所述PCR產(chǎn)物A1、所述PCR產(chǎn)物Bl和所述PCR產(chǎn)物Cl的大小，如 果所述PCR產(chǎn)物Bl中含有500bp-750bp的DNA片段（即699bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn) 物Al中含有500bp-750bp的DNA片段（即699bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物Cl中含有 500bp-750bp的DNA片段（即663bp的DNA片段），所述待測(cè)樣品含有或候選含有尖孢鐮刀 菌古巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小種；如果所述PCR產(chǎn)物Bl中含有500bp-750bp的DNA片 段（即699bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物Al中含有500bp-750bp的DNA片段（即699bp 的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物Cl中不含500bp-750bp的DNA片段（即不含663bp的DNA片 段），所述待測(cè)樣品含有或候選含有尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種，所述尖孢鐮刀菌 古巴專化型4號(hào)生理小種不為尖孢鐮刀菌古巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小種；如果所述PCR 產(chǎn)物Bl中含有500bp-750bp的DNA片段（即699bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物Al中不 含500bp-750bp的DNA片段（即不含699bp的DNA片段），所述待測(cè)樣品含有或候選含有尖 孢鐮刀菌古巴?；?，所述尖孢鐮刀菌古巴?；筒粸榧怄哏牭毒虐蛯；?號(hào)生理小 種；如果所述PCR產(chǎn)物Bl中不含500bp-750bp的DNA片段（即不含699bp的DNA片段）， 所述待測(cè)樣品不含或候選不含尖孢鐮刀菌古巴?；停?br>[0033] H2)下述 H21)和 H22):
[0034] H21)以待測(cè)生物樣品的核酸（DNA或RNA或以RNA為模板轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)為模 板，用所述A進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物A2 ;以所述待測(cè)生物樣品的DNA為模板，用所述B 進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物B2 ;以所述待測(cè)生物樣品的核酸（DNA或RNA或以RNA為模板 轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)為模板，用所述C進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物C2 ;
[0035] H22)檢測(cè)H21)所述PCR產(chǎn)物A2、所述PCR產(chǎn)物B2和所述PCR產(chǎn)物C2的大小，如 果所述PCR產(chǎn)物B2中含有500bp-750bp的DNA片段（即730bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn) 物A2中含有500bp-750bp的DNA片段（即699bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物C2中含有 500bp-750bp的DNA片段（即663bp的DNA片段），所述待測(cè)樣品含有或候選含有尖孢鐮刀 菌古巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小種；如果所述PCR產(chǎn)物B2中含有500bp-750bp的DNA片 段（即730bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物A2中含有500bp-750bp的DNA片段（即699bp 的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物C2中不含500bp-750bp的DNA片段（即不含663bp的DNA片 段），所述待測(cè)樣品含有或候選含有尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種，所述尖孢鐮刀菌 古巴?；?號(hào)生理小種不為尖孢鐮刀菌古巴?；蛠啛釒?號(hào)生理小種；如果所述PCR 產(chǎn)物B2中含有500bp-750bp的DNA片