鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)是一種世界性分布的土傳病原真菌，寄主范圍 廣泛，可引起瓜類、茄科、香蕉、棉、豆科及花丼等100多種植物枯萎病的發(fā)生。盡管尖孢鐮 刀菌在整體上具有廣泛的寄主范圍，但單個菌株僅能侵染一種或少數(shù)幾種植物種類。在不 同的寄主上又分為不同的生理?；停壳耙褕蟮赖纳韺；陀?50多種，有些?；?依據(jù)對不同品種的特異性被進(jìn)一步劃分為不同的生理小種，大多數(shù)?；桶?個或更多 的生理小種，而一小部分是單型。某生理專化型可能在特定的植物種類上引起病害，但是屬 于其他專化型的菌株對同樣的這種特定植物種類可能無害甚至對其有利。
[0003] 香蕉枯萎病，又稱香蕉鐮刀菌枯萎病、巴拿馬病、黃葉病，是由尖孢鐮刀菌古巴專 化型（Fusarium oxyporum f.sp.Cubense，F(xiàn)oc)引起的破壞植株維管束而導(dǎo)致植株死亡的 一種毀滅性病害，目前，除地中海、印度洋、南太平洋一些島嶼國家外，幾乎所有香蕉種植區(qū) 均有遭受該病害危害的報導(dǎo)。依據(jù)尖孢鐮刀菌古巴專化型（Foc)對不同品種香蕉的侵染 特異性將其劃分為4個生理小種（race):其中1號生理小種（Focl)侵染"大蜜哈" [Gros michel (AAA) ]、Silk (AAB)、Taiwan Latundan (AAB)、IC2 (AAAA)和粉蕉（ABB) ;2 號生理小種 (Foc2)只侵染雜種三倍體Bluggoe及ABB基因型的相關(guān)煮食蕉類；3號生理小種侵染野生 揭尾蕉屬（Heliconia spp.)而不是香蕉類，因而被劃分出Foc ;4號生理小種（Foc4)則侵 染所有的Cavendish類香蕉（AAA)及其他對1號與2號生理小種敏感的蕉類?；贔oc4是 否能在熱帶環(huán)境條件下對Cavendish類香蕉致病，又將Foc4進(jìn)一步劃分為"尖孢鐮刀菌古 巴?；蜔釒?號生理小種"(TR4)與"尖孢鐮刀菌古巴?；蛠啛釒?號生理小種"(ST4)， 尖孢鐮刀菌古巴?；蛠啛釒?號生理小種僅在亞熱帶條件下侵染Cavendish類香蕉。我 國廣東、廣西、福建、海南、云南和臺灣等主要香蕉種植區(qū)也均已發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病，且香蕉枯 萎病的發(fā)病加重趨勢明顯。目前急需一套快速鑒定香蕉是否感染香蕉枯萎病菌的方法，為 生產(chǎn)安全健康香蕉種苗保駕護(hù)航。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定香蕉枯萎病菌中的尖孢鐮刀菌古巴?；?型和/或尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的成套引物， 其名稱為成套引物甲。
[0006] 本發(fā)明所提供的成套引物甲，由名稱為A的PCR引物對和名稱為B的PCR引物對 組成；
[0007] 所述A由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的兩條單鏈DNA組成；所述 B由序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的兩條單鏈DNA組成。
[0008] 本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是如何鑒定香蕉枯萎病菌中的尖孢鐮刀菌古 巴?；?。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的PCR引物 對。
[0010] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的PCR引物對，為所述B。
[0011] 本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是如何鑒定香蕉枯萎病菌中的尖孢鐮刀菌古 巴?；?號生理小種。
[0012] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的PCR引物 對。
[0013] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的PCR引物對，為所述A。
[0014] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)。
[0015] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)為下述Ll-Nn中的任一種：
[0016] L1、含有所述成套引物甲的系統(tǒng)；
[0017] Mm、含有所述B的系統(tǒng)；
[0018] Nn、含有所述A的系統(tǒng)。
[0019] 上述鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)，可包括通過PCR鑒定或輔助鑒定香蕉 枯萎病菌所需的試劑和儀器。具體來說，鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)可包括所述 成套引物甲、所述B或所述A以及PCR所需要的其它試劑和儀器。
[0020] 上述鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的系統(tǒng)還可僅包括所述成套引物甲、所述B或 所述A。
[0021] 所述成套引物甲中的各引物對以及PCR所需要的其它試劑均可獨立包裝。所述B 以及PCR所需要的其它試劑均可獨立包裝。所述A以及PCR所需要的其它試劑均可獨立包 裝。
[0022] PCR所需要的其它試劑可包括DNA聚合酶（DNA Polymerase)和/或10 XPCR buffer和/或dNTPs。PCR所需要的儀器可為PCR儀。
[0023] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的方法。
[0024] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的方法，為下述LI)或L2):
[0025] LI)下述 L11)和 L12):
[0026] L11)以待測生物樣品的核酸（DNA或RNA或以RNA為模板轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)為模 板，用所述A進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物Al ;以所述待測生物樣品的RNA或以RNA為模板 轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用所述B進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物Bl ;
[0027] L12)檢測L11)所述PCR產(chǎn)物Al和所述PCR產(chǎn)物Bl的大小，如果所述PCR產(chǎn) 物Bl中含有500bp-750bp的DNA片段（即699bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物Al中含有 500bp-750bp的DNA片段（即699bp的DNA片段），所述待測樣品含有或候選含有尖孢鐮刀 菌古巴專化型4號生理小種；如果所述PCR產(chǎn)物Bl中含有500bp-750bp的DNA片段（即 699bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物Al中不含500bp-750bp的DNA片段（即不含699bp的 DNA片段），所述待測樣品含有或候選含有尖孢鐮刀菌古巴?；停黾怄哏牭毒虐蛯?化型不為尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種；如果所述PCR產(chǎn)物Bl中不含500bp-750bp 的DNA片段（即不含699bp的DNA片段），所述待測樣品不含或候選不含尖孢鐮刀菌古巴專 化型；
[0028] L2)下述 L21)和 L22):
[0029] L21)以待測生物樣品的核酸（DNA或RNA或以RNA為模板轉(zhuǎn)錄得到的cDNA)為模 板，用所述A進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物A2 ;以所述待測生物樣品的DNA為模板，用所述B 進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物B2 ;
[0030] L22)檢測L21)所述PCR產(chǎn)物A2和所述PCR產(chǎn)物B2的大小，如果所述PCR產(chǎn) 物B2中含有500bp-750bp的DNA片段（即730bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物A2中含有 500bp-750bp的DNA片段（即699bp的DNA片段），所述待測樣品含有或候選含有尖孢鐮刀 菌古巴?；?號生理小種；如果所述PCR產(chǎn)物B2中含有500bp-750bp的DNA片段（即 730bp的DNA片段），所述PCR產(chǎn)物A2中不含500bp-750bp的DNA片段（即不含699bp的 DNA片段），所述待測樣品含有或候選含有尖孢鐮刀菌古巴?；?，所述尖孢鐮刀菌古巴專 化型不為尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種；如果所述PCR產(chǎn)物B2中不含500bp-750bp 的DNA片段（即不含730bp的DNA片段），所述待測樣品不含或候選不含尖孢鐮刀菌古巴專 化型。
[0031] 上述方法中，所述香蕉枯萎病菌可為尖孢鐮刀菌古巴專化型和/或尖孢鐮刀菌古 巴?；?號生理小種。
[0032] 上述方法中，用所述B進(jìn)行PCR擴(kuò)增時的退火溫度可為54°C。用所述A進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時的退火溫度可為56°C。
[0033] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的方法。
[0034] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定香蕉枯萎病菌的方法，為下述M或N :
[0035] M 下述 Ml)或 M2):
[0036] Ml)下述 Mil)和 M12):
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