用于多靶點基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種用于多靶點基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計新方法，該方法使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以設(shè)計，進(jìn)而使Arm-PCR多重反應(yīng)變得簡單可行。
【背景技術(shù)】
[0002]擴(kuò)增子搖救多重PCR( amp I icon rescue multiplex PCR,以下簡稱 Arm-PCR)技術(shù)，其原理是針對多重PCR體系中的每個靶序列，分別設(shè)計兩對套式引物，使其可以形成4種擴(kuò)增引物組合；由于每個靶序列都有4種可能的擴(kuò)增模式，從而使得尋找不同靶序列最佳通用的擴(kuò)增條件變得簡單可行，最終實現(xiàn)對多種靶基因的高特異性、高靈敏度的同步擴(kuò)增。
[0003]LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplificat1n)法是 2000 年由 Notomi 等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法采用特異地識別靶序列上6個區(qū)域的4條引物(2條外引物，2條內(nèi)引物)及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65°C左右進(jìn)行核酸的指數(shù)級擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率可達(dá)109?1010個拷貝數(shù)量級。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于多靶點基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計新方法，可以使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以成功設(shè)計，進(jìn)而使Arm-PCR多重反應(yīng)變得簡單可行。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種用于多靶點基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計新方法，其是通過以下步驟實現(xiàn)的:
a、用LAMP軟件代替icubate2.0在線軟件設(shè)計小片段靶基因的引物:將靶基因片段的序列導(dǎo)入LAMP軟件中，按照Arm-PCR引物設(shè)計的參數(shù)對LAMP軟件中的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整；
b、將LAMP軟件設(shè)計出的內(nèi)引物前面的成環(huán)引物序列換成Arm-PCR引物的通用接頭序列:icubate 2.0在線軟件設(shè)計出的第一輪引物分為外向引物與內(nèi)向引物，這與LAMP軟件設(shè)計出的引物相似，所以將LAMP軟件設(shè)計出的內(nèi)引物前面的成環(huán)引物序列換成Arm-PCR弓丨物的通用接頭序列，從而轉(zhuǎn)換成Arm-PCR引物；
c、Arm-PCR反應(yīng)體系的配制；
d、Arm-PCR反應(yīng)條件的設(shè)定與運(yùn)行；
e、Arm-PCR產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測:在Arm-PCR第二步擴(kuò)增所需要的超級引物的5’端要加上熒光標(biāo)記，才能進(jìn)行后續(xù)的毛細(xì)管電泳檢測。
[0006]以轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2 NOS終止子和轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127為例，引物組是由LAMP軟件設(shè)計的，將其內(nèi)向上下游引物的成環(huán)弓I物換成Arm-PCR弓丨物的通用接頭序列，從而轉(zhuǎn)換成Arm-PCR引物，其引物組包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向內(nèi)引物F1、反向內(nèi)引物Ri，用于Arm-PCR的第一步擴(kuò)增；5 ’端ROX標(biāo)記的超級上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步擴(kuò)增，其接頭序列與超級引物的序列相同，核苷酸序列分別如下所示:
1.A5547-127 正向外引物 Fo:CACAAGAGTGGATTGATGATCTAG ； A5547-127 反向外引物 Ro:CTCATGCAACCTAACAGATGG ；
A5547-127正向內(nèi)引物
Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGGTTGGTTGCTGAGGTTG ；
A5547-127反向內(nèi)引物
Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGCCTATAACAGCAACCACAG ；
2.GTS 40-3-2 NOS 終止子正向外引物 Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT ;
GTS 40-3-2 NOS 終止子反向外引物 Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG ;
GTS 40-3-2 NOS終止子正向內(nèi)引物
Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC;
GTS 40-3-2 NOS終止子反向內(nèi)引物 Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT ；
3.超級上游引物Fs:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC ；
超級下游引物 Fs:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT ；
利用Arm-PCR檢測引物組進(jìn)行Arm-PCR反應(yīng)，包括如下步驟:以轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127和轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2 NOS終止子的質(zhì)粒為模板；PCR擴(kuò)增反應(yīng):在PCR管中配制第一步反應(yīng)體系:引物液2.5 μ 1，反應(yīng)液Mix 12.5μ 1，轉(zhuǎn)基因大豆Α5547-127和GTS 40-3-2NOS終止子質(zhì)粒各2?5μ1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ I ;設(shè)置空白對照反應(yīng)時，用雙蒸水代替模板；將配制好的PCR管混勻后離心，并于95°C 15min，94°C 30s,60°C 90s,72°C 60s，15 個循環(huán)；94°C 15s，70°C 90s，6 個循環(huán)；60°C延伸 30min，最后 4°C保存；第二步PCR反應(yīng)體系為:超級引物液I μ 1，反應(yīng)液Mix 12.5 μ 1，第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物I?2μ 1，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 μ I ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于95°C 15min ；94°C 30s,60°C 90s, 72°C 60s, 30個循環(huán)；60°C延伸30min，最后4°C保存；結(jié)果判斷:通過毛細(xì)管電泳檢測Arm-PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:icubate 2.0開放平臺是網(wǎng)上的免費多重PCR試劑設(shè)計軟件，由于icubate 2.0軟件對靶基因的長度有要求，通常在100bp以上，這樣對于小片段的靶基因就無法設(shè)計Arm-PCR引物，且icubate 2.0軟件設(shè)計出的Arm-PCR引物只有兩組，從而限制了多重引物組的篩選。而LAMP軟件設(shè)計出的引物也包含2條外引物和2條內(nèi)引物，與icubate 2.0軟件設(shè)計出的Arm-PCR引物相似，只要將LAMP軟件設(shè)計出的內(nèi)向上下游引物的成環(huán)引物換成Arm-PCR引物的通用接頭序列,從而轉(zhuǎn)換成Arm-PCR引物。而且LAMP軟件設(shè)計出的引物組較多，有利于多重引物組的篩選，本發(fā)明用于多靶點基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計新方法，可以使小片段靶基因的Arm-PCR引物得以成功設(shè)計，進(jìn)而使Arm-PCR多重反應(yīng)變得簡單可行。
【附圖說明】
[0008]圖1是實施例1轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果圖；
圖2是實施例1GTS 40-3-2 NOS終止子的Arm-PCR毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果圖；
圖3是空白對照組的毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0009]以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0010]實施例1:一種用于多靶點基因擴(kuò)增的Arm-PCR引物設(shè)計新方法，其是通過以下步驟實現(xiàn)的:a、用LAMP軟件代替icubate2.0在線軟件設(shè)計小片段靶基因的引物:將靶基因片段的序列導(dǎo)入LAMP軟件中，按照Arm-PCR引物設(shè)計的參數(shù)對LAMP軟件中的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整；b、將LAMP軟件設(shè)計出的內(nèi)引物前面的成環(huán)弓I物序列換成Arm-PCR弓丨物的通用接頭序列:icubate2.0在線軟件設(shè)計出的第一輪弓I物分為外向弓I物與內(nèi)向引物，這與LAMP軟件設(shè)計出的引物相似，所以將LAMP軟件設(shè)計出的內(nèi)引物前面的成環(huán)引物序列換成Arm-PCR弓丨物的通用接頭