用于檢測藍(lán)舌病病毒的基因芯片及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物芯片領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及藍(lán)舌病病毒的基因檢測芯片及 其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)舌?。˙luetongue disease, BT)是由藍(lán)舌病毒（Bluetongue virus, BTV)引起 的急性、烈性非接觸性蟲媒傳染病。BTV主要感染綿羊、山羊、牛等家養(yǎng)和野生反芻動(dòng)物， 常見臨床癥狀為高熱、舌頭變藍(lán)和口腔粘膜水腫出血等。一般情況下，該病的死亡率為 20% -30%，但對于某些品種的綿羊，致死率可高達(dá)90%，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展。藍(lán)舌病 病毒主要通過吸血昆蟲（如庫蠓等）吸吮帶毒血液后叮咬易感動(dòng)物進(jìn)行傳播，因此該病的 爆發(fā)流行具有一定的季節(jié)性、地方性和周期性。另外，該病毒也可通過精液和胎盤進(jìn)行垂 直傳播。藍(lán)舌病是一種世界性危害的蟲媒性傳染病，OIE將其列為A類疫病，我國將其列為 一類動(dòng)物疫病，主要分布于美洲、非洲、澳洲及亞洲地區(qū)，我國也在云南、湖北、安徽、四川、 山西、廣西等多個(gè)地區(qū)分離得到BTV。近年來，隨著全球氣候變暖和國際動(dòng)物貿(mào)易的逐年增 加，藍(lán)舌病在全球范圍內(nèi)有擴(kuò)大流行的趨勢，可感染多種動(dòng)物，對畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和人類健 康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
[0003] 藍(lán)舌病病毒屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，病毒粒子呈二十面體對稱，無囊膜， 由10個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白，為迄今為止分子量最 大的RNA病毒。目前已證實(shí)BTV至少存在24個(gè)血清型，各血清型間交叉保護(hù)力低。另外， 藍(lán)舌病病毒常與小反芻獸疫、水皰性口炎、豬水皰病毒等混合感染，大大增加對該病的診斷 難度。我國藍(lán)舌病的診斷和檢疫的標(biāo)準(zhǔn)（GB/T18636-2002)方法主要有病毒的分離鑒定、抗 原捕獲ELISA(抗原捕獲ELISA)、定型微量中和試驗(yàn)和空斑及空斑抑制定型試驗(yàn)等用于病 原的檢測，瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID)和競爭ELISA (C-ELISA)用于抗體的檢測。病毒分離 鑒定是OIE推薦的診斷BTV的方法之一，但是該方法存在培養(yǎng)周期長的局限性。血清學(xué)檢 測方法可用于病毒分離物的血清型鑒定，也可用于BTV特異性抗體的檢測。BTV核酸檢測技 術(shù)包括通用型檢測和分型檢測，主要包括核酸探針技術(shù)、RT-PCR、熒光定量PCR、基因芯片檢 測技術(shù)等。藍(lán)舌病尚無有效的治療方法和疫苗，早發(fā)現(xiàn)、早處理依靠于快速、準(zhǔn)確的檢測手 段。因而能夠準(zhǔn)確快速檢測出BTV，在動(dòng)物及其副產(chǎn)品的進(jìn)出口檢疫中具有重要的意義。
[0004] 基因芯片（Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探針密集排列在經(jīng)過共價(jià)結(jié)合醛基、 氨基或多聚賴氨酸的固相支持物所形成的探針陣列，在適當(dāng)?shù)臏囟取穸葪l件下，利用特異 性探針與經(jīng)過適當(dāng)方式標(biāo)記的待檢樣品DNA通過堿基互補(bǔ)配對雜交，然后通過相應(yīng)的檢測 設(shè)備，檢測雜交信號的位置和強(qiáng)弱，判斷樣品種類，完成病毒檢測和基礎(chǔ)研宄等方面的工 作。該方法具有高通量、平行化、微量化、自動(dòng)化、低成本的優(yōu)點(diǎn)。因此，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用 于診斷檢測、差異表達(dá)分析、測序等諸多領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、節(jié)時(shí) 省力并且易于觀察結(jié)果的微陣列芯片，檢測藍(lán)舌病病毒的基因芯片。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：用于檢測藍(lán)舌病病毒的基因芯片包 括：PCR反應(yīng)混合液管、Taq聚合酶、PCR陽性對照、PCR陰性對照、ddH 20、檢測芯片、芯片探針 的點(diǎn)樣分布、芯片蓋片、芯片圍欄、雜交液、雜交陽性對照、雜交盒，采用基因芯片微量點(diǎn)樣 技術(shù)，將待測樣品探針與各種質(zhì)控探針固定在經(jīng)過化學(xué)修飾的醛基基片上，形成的微陣列。 微陣列包括質(zhì)控探針區(qū)和待測樣品探針區(qū)，其中所述質(zhì)控探針區(qū)內(nèi)設(shè)置下述分區(qū)：
[0007] 點(diǎn)樣位置質(zhì)控分區(qū)Pl，包含至少一個(gè)點(diǎn)樣位置質(zhì)控探針：SEQ ID NO. 2 ;
[0008] 雜交陽性質(zhì)控分區(qū)P2,包含至少一個(gè)雜交陽性質(zhì)控探針：SEQ ID NO. 3 ;
[0009] 雜交陰性質(zhì)控分區(qū)N，包含點(diǎn)樣緩沖液；
[0010] 所述待測樣品探針區(qū)包含至少一個(gè)藍(lán)舌病病毒探針：SEQ ID NO. 1。
[0011] 利用上述基因芯片檢測藍(lán)舌病病毒的檢測方法，具體步驟如下：
[0012] (1)待測樣品制備：按照商品化RNA提取試劑盒使用說明書提取待測組織或病毒 的細(xì)胞增殖液的全基因組，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，獲得待檢樣品DNA ;
[0013] (2) PCR 擴(kuò)增：25 μ L PCR 反應(yīng)液包含：rTaq 酶 12.5 μ L、引物 Mix 5.4 μ L、待測樣 品DNA 3 μ L、無核酸酶滅菌水4. 1 μ L ;
[0014] 其中，所述引物Mix含有：
[0015] 20 μ mol/L藍(lán)舌病病毒特異上游引物SEQ ID NO. 4 0.2 μ L，
[0016] 20 μ mol/L藍(lán)舌病病毒特異下游引物SEQ ID NO. 5 0. 2 μ L，
[0017] 20 μ mol/L PCR 通用上游引物 SEQ ID NO. 6 4 yL，
[0018] 20 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID NO. 7 I yL ;
[0019] 按如下步驟進(jìn)行擴(kuò)增：94°C 5min ;94°C 30sec，56°C 30sec，72°C 25sec 循環(huán) 12 次； 94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C 25sec 循環(huán) 30 次；72°C IOmin ;
[0020] (3)雜交：首先配制雜交液：雜交緩沖液7. 9 μ L、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7 μ L、雜交陽性對 照0. 1 μ L，混勻后95°C變性8min，冰上放置5min，然后采用15 μ L雜交液進(jìn)行雜交；雜交 緩沖液每1000 μ L包括20 X SSC 500 μ L、10 % SDS 10 μ L及無核酸酶滅菌水490 μ L。
[0021] (4)結(jié)果判讀：用微陣列芯片掃描儀掃描分析，去除陰性對照背景，與芯片雜交說 明對照，判定結(jié)果。
[0022] 本發(fā)明綜合基因芯片的優(yōu)點(diǎn)，利用寡聚核苷酸探針的穩(wěn)定性，建立一種快速、準(zhǔn)確 鑒定藍(lán)舌病病毒的基因芯片檢測技術(shù)，為控制藍(lán)舌病病毒的傳播及進(jìn)出境動(dòng)物的檢疫具有 重要作用。
[0023] (1)成功地構(gòu)建了 BTV檢測基因芯片：本發(fā)明所制備的藍(lán)舌病病毒探針可與對應(yīng) 病毒目的基因進(jìn)行特異性結(jié)合，雜交信號較強(qiáng)且穩(wěn)定。
[0024] (2)制備的檢測基因芯片具有良好的方法學(xué)特征：本發(fā)明建立了一種特異性好、 靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)和節(jié)時(shí)省力的基因芯片檢測方法。
[0025] (3)檢測基因芯片的構(gòu)建，為混合感染疾病的同步檢測和鑒別診斷提供快速、高效 的手段，為今后出入境動(dòng)物檢疫和相應(yīng)疫病控制提供了技術(shù)保障。對滿足進(jìn)出境動(dòng)物檢疫 工作的需要，控制藍(lán)舌病病毒的傳播，保障我國的畜牧業(yè)安全、健康發(fā)展具有十分重要的意 義。
【附圖說明】
[0026] 圖1芯片探針分布示意圖；
[0027] 圖2藍(lán)舌病病毒雜交及特異性結(jié)果圖；
[0028] 圖3藍(lán)舌病病毒基因芯片檢測靈敏度結(jié)果圖；
[0029] 圖中：Pl-點(diǎn)樣位置質(zhì)控分區(qū)；P2-雜交陽性質(zhì)控分區(qū)；1- 口蹄疫病毒A型探針分 區(qū)；2- 口蹄疫病毒亞洲I型探針分區(qū)；3- 口蹄疫病毒通用型探針分區(qū)；4- 口蹄疫病毒O型 探針分區(qū)；5-水皰性口炎病毒探針分區(qū)；6-豬水皰病病毒探針分區(qū)；7-藍(lán)舌病病毒探針分 區(qū)；8-小反芻獸疫病毒探針分區(qū)；N-雜交陰性質(zhì)控分區(qū)；
[0030] 雜交說明：Pl :探針固定陽性對照，監(jiān)控芯片點(diǎn)樣過程，芯片雜交前后都應(yīng)陽性；
[0031] P2 :雜交陽性對照，監(jiān)控芯片雜交過程，檢測任何樣品都應(yīng)陽性；
[0032] N :雜交陰性對照，檢測任何樣品都應(yīng)陰性；
[0033] 藍(lán)舌病病毒cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交結(jié)果：除質(zhì)控探針符合要求外，7號探針 殼；
[0034] 圖 3 中，A:2.99X 108copies/uL ;B:2.99X 107copies/uL ;C:2.99X 106copies/uL ; D:2. 99X 105copies/uL Ε:2· 99X 104copies/uL ;F:2. 99X 103copies/uL。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 提供具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用不限于以下 實(shí)施例。
[0036] 實(shí)施例1，本發(fā)明是基于對藍(lán)舌病病毒的細(xì)胞增殖，提取病毒基因組。選取不同的 特異保守序列設(shè)計(jì)了 1條寡核苷酸探針，可與相應(yīng)的病毒CDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性結(jié) 合，PCR進(jìn)行基因組擴(kuò)增時(shí)，通用上游引物5'端利用Cy3熒光色素進(jìn)行標(biāo)記，探針可與此產(chǎn) 物在50°C下進(jìn)行雜交。根據(jù)熒光信號位置、強(qiáng)度判斷雜交結(jié)果，以此來檢測藍(lán)舌病病毒。根 據(jù)Genbank網(wǎng)站上公布的藍(lán)舌病病毒基因序列利用Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)PCR 引物 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 和 SEQ ID NO. 7?？寺』蛐蛄?，