包含至少兩個不同實(shí)體的分子的生產(chǎn)和選擇方法及其用圖
【專利說明】包含至少兩個不同實(shí)體的分子的生產(chǎn)和選擇方法及其用途
[0001] 本文報道了通過使用轉(zhuǎn)肽酶，諸如分選酶A(sortase A)生產(chǎn)和選擇通過兩個不同 實(shí)體，諸如結(jié)合實(shí)體、效應(yīng)子實(shí)體、或有效負(fù)荷的組合形成的分子，其中至少兩個不同實(shí)體 在體內(nèi)連接。這是通過將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號（retention signal)添加至分選酶和實(shí)體之一 而實(shí)現(xiàn)的。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在過去的幾年里，已經(jīng)開發(fā)并臨床測試了多種特異性治療蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞表面 受體的抗體、抗體片段和配體。示例性蛋白質(zhì)是抗體、Fc區(qū)綴合物，或靶向遞送載體。已經(jīng) 將這些治療蛋白質(zhì)中的一些綴合到若干種類的治療毒素上，如小分子藥物、酶、放射性同位 素、蛋白毒素和用于向患者特定遞送的其他毒素。
[0004] 向疾病位點(diǎn)有效遞送是任何治療分子高效和低毒的前提。例如，抗體可以參與到 該背景中。如果抗體本身不是治療性原理的，那么效應(yīng)子分子綴合到抗體上使得可以實(shí)現(xiàn) 藥物在人體內(nèi)想要位點(diǎn)上準(zhǔn)確定位。這增加了該靶區(qū)域內(nèi)有效藥物的濃度，由此優(yōu)化活性 劑的治療效力。此外，利用靶向遞送，臨床醫(yī)師能夠降低治療劑的總體劑量并因此最小化全 身暴露-如果藥物有效負(fù)荷具有相關(guān)毒性或如果待用于治療慢性狀況，這是特別相關(guān)的事 情（參見例如 McCarron, P. A.，等，Mol. Interventions 5 (2〇〇5) 368_38〇) 〇
[0005] 在WO 2010087994中報道了用于連接的方法及其用途。由Marvin, J. S.，等（Acta Pharmacol. Sinica 26(2005)649-658)報道了 IgG 樣雙特異性抗體的重組方法。Levary, D. A.，等（PLoS one，6(2011)el8342. I_el8342. 6)報道了由分選酶A催化的蛋白質(zhì)-蛋白 質(zhì)融合。在WO 2013/003555中報道了分選酶安裝用于蛋白質(zhì)連接的掣子化學(xué)柄（click chemistry handles)的用途。
[0006] Strijbis，K.等（Traffic 13(2012)780-789)報道了使用分選酶在活細(xì)胞中的 蛋白質(zhì)連接。據(jù)稱Ca2+-依賴性金黃色葡萄球菌（S. aureus)分選酶A在胞內(nèi)是非功能性 的，但是Ca2+-非依賴性化膿鏈球菌（S. pyogenes)分選酶A在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和哺乳動物HEK293T細(xì)胞的胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)腔中均是功能性的。
[0007] 發(fā)明概沐
[0008] 本文報道了通過使用金黃色葡萄球菌（S. aureus)的Ca2+-依賴性酶分選酶A來在 胞內(nèi)體內(nèi)生產(chǎn)第一多肽結(jié)構(gòu)域與第二多肽結(jié)構(gòu)域的酶催化的（即酶促的）綴合物的方法， 以此多肽結(jié)構(gòu)域之一和可溶分選酶A含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號。
[0009] 此技術(shù)特別適用于快速生成例如，第一組多肽結(jié)構(gòu)域（例如第一組結(jié)合結(jié)構(gòu)域諸 如抗體可變結(jié)構(gòu)域的同族對（cognate pair))和第二組多肽結(jié)構(gòu)域（例如第二組結(jié)合結(jié)構(gòu) 域諸如抗體可變結(jié)構(gòu)域的同族對，但針對與第一組所針對的不同的表位/抗原，或有效負(fù) 荷分子的組）的組合的文庫。此文庫可例如，通過在HEK細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染容易地生成，并且 之后可以就例如，預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)或預(yù)期的性質(zhì)篩選獲得的組合。
[0010] 如本文報道的一個方面是生產(chǎn)包含至少兩個多肽結(jié)構(gòu)域的多肽的方法，所述方法 包括步驟為
[0011]-培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含
[0012] a)編碼具有C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號的可溶分選酶A的核酸，
[0013] b)編碼在其C末端處或在其C末端區(qū)中包含后接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號的分選酶基序的 第一多肽結(jié)構(gòu)域的核酸，和
[0014] c)編碼在其N末端處包含至少兩個甘氨酸殘基的寡甘氨酸基序的第二多肽結(jié)構(gòu) 域的核酸，
[0015] 由此細(xì)胞分泌第一多肽結(jié)構(gòu)域和第二多肽結(jié)構(gòu)域的分選酶A(介導(dǎo)的/催化的） 綴合物，
[0016] 從而生產(chǎn)包含至少兩個多肽結(jié)構(gòu)域的多肽。
[0017] 如本文報道的一個方面是生產(chǎn)包含至少兩個結(jié)合實(shí)體的多特異性結(jié)合物的方法， 所述方法包括步驟為
[0018] -培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含
[0019] a)編碼具有C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號的可溶分選酶A的核酸，
[0020] b)編碼在其C末端處或在其C末端區(qū)中包含后接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號的分選酶基序的 第一結(jié)合實(shí)體的核酸，和
[0021] C)編碼在其N末端處至少包含二甘氨酸（diglycine)的第二結(jié)合實(shí)體的核酸，
[0022] 由此細(xì)胞分泌第一結(jié)合實(shí)體和第二結(jié)合實(shí)體的分選酶A(介導(dǎo)的/催化的）綴合 物，
[0023] 從而第一結(jié)合實(shí)體特異性結(jié)合第一抗原或靶，并且第二結(jié)合實(shí)體特異性結(jié)合第二 抗原或靶，
[0024] 從而生產(chǎn)包含至少兩個結(jié)合實(shí)體的多特異性結(jié)合物。
[0025] 在全部方面的一個實(shí)施方案中分選酶A是金黃色葡萄球菌（S. aureus)的分酶A。 在一個實(shí)施方案中編碼具有C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號的（可溶）分選酶A的核酸編碼SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
[0026] 本文報道了提供用于在需要治療的患者中治療疾病，如癌癥或病毒感染的定制的 高度特異的治療分子的方法，以此所述治療分子適合患者的疾病特征和/或患者的基因型 /表型。
[0027] 通過考慮患者攜帶疾病/受影響細(xì)胞的基因型/表型制備定制分子實(shí)現(xiàn)這種適 合。
[0028] 在第一步中，確定旨在利用治療分子靶向的細(xì)胞的基因型/表型（疾病特異性細(xì) 胞表面分子的存在和數(shù)目/數(shù)量）。這例如通過細(xì)胞成像技術(shù)，如使用熒光標(biāo)記的單特異性 (治療性或診斷性）抗體對來自例如血液和/或活組織檢查材料的患者細(xì)胞免疫組織化學(xué) 染色（IHC，免疫組織化學(xué)）來實(shí)現(xiàn)。或者，可以在利用標(biāo)記的治療或診斷抗體染色后使用基 于FACS的方法分析細(xì)胞的基因型/表型。體內(nèi)成像技術(shù)，包括光學(xué)成像、分子成像、熒光成 像、生物發(fā)光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活體顯微鏡檢查也可以用于確定患者的疾病相關(guān) 細(xì)胞的基因型/表型。根據(jù)患者的疾病相關(guān)細(xì)胞確定的基因型/表型，可以/進(jìn)行選擇靶 向/結(jié)合實(shí)體的定制組合，并且組合在治療分子中。該治療分子可以是例如雙特異性抗體。
[0029] 此類定制的治療分子i)將是高度特異的，ii)將具有好的治療功效，并且iii)與 常規(guī)選擇的治療劑相比將誘導(dǎo)較少的和/或較不嚴(yán)重的副作用。這可以通過提供具有改善 的靶向和/或改善的定制遞送性質(zhì)，例如對其預(yù)期的作用位點(diǎn)遞送治療有效負(fù)荷的治療分 子來實(shí)現(xiàn)。
[0030] 可以通過與常規(guī)選擇的治療分子相比對靶向治療分子的較高的/增加的選擇性 和/或特異性來實(shí)現(xiàn)治療分子向其作用位點(diǎn)，如例如癌細(xì)胞的改善遞送。治療分子包含至 少兩個實(shí)體，其特異性結(jié)合或可以被不同蛋白質(zhì)結(jié)合（例如兩種不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物）。
[0031] 可以通過兩個靶向?qū)嶓w同時結(jié)合其各自的靶標(biāo)/表位，或通過兩個多肽結(jié)構(gòu)域與 其相互作用伙伴的同時結(jié)合，或通過其混合，實(shí)現(xiàn)定制治療分子的增加的選擇性和/或特 異性。
[0032] 尤其適合的是對其各自的靶標(biāo)/表位具有低親和力到中等親和力的兩個結(jié)合實(shí) 體的組合。此外，脫靶結(jié)合被極大地減少或甚至可以被完全消除。
[0033] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用本文報道的方法能夠定制例如雙特異性結(jié)合物諸如，特異性針對細(xì) 胞（諸如癌細(xì)胞）表面上發(fā)現(xiàn)的兩種表面標(biāo)志物的雙特異性抗體。由于結(jié)合特異性是由 起始組分單獨(dú)提供的，能夠簡單地通過確定細(xì)胞，例如癌細(xì)胞上存在的表面標(biāo)志物，并通過 酶促流程綴合特異性結(jié)合這些表面標(biāo)志物或其各自配體的各抗體片段，定制多特異性靶向 和結(jié)合分子。由于酶促綴合是通過酶分選酶A，在一個實(shí)施方案中是通過金黃色葡萄球菌 的分選酶A進(jìn)行的，獲得的雙特異性結(jié)合物（雙特異性抗體）的特征為存在氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸殘基）。
[0034] 如本文報道的一個方面是選擇特異性結(jié)合兩種不同表位或抗原的多特異性結(jié)合 物的方法，所述方法包括步驟為
[0035] -從包含第一結(jié)合實(shí)體和第二結(jié)合實(shí)體的不同組合的多種多特異性結(jié)合物中選擇 特異性結(jié)合兩種不同表位或抗原的多特異性結(jié)合物。
[0036] 如本文報道的一個方面是選擇雙特異性抗體的方法，所述方法包括以下步驟
[0037] (i)測定含有細(xì)胞的樣品中存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物并至少選擇其中第一表面標(biāo)志 物和第二表面標(biāo)志物，
[0038] (i i)用以下轉(zhuǎn)染細(xì)胞：(a)核酸，其編碼在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸 序列LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸殘基）、后接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號KDEL(SEQ ID N0:02)的抗體Fab，或scFab片段，或scFv抗體，以此Fab，或scFab片段，或scFv抗體 特異性結(jié)合第一表面標(biāo)志物或其配體，（b)核酸，其編碼包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈 和抗體重鏈Fc區(qū)多肽的單臂抗體片段，以此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈?zhǔn)潜舜嘶パa(bǔ)的 同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二表面標(biāo)記物或其配體特異性結(jié)合的 抗原結(jié)合位點(diǎn)，以此全長抗體重鏈和抗體重鏈Fc區(qū)多肽通過形成抗體鉸鏈區(qū)的一個或多 個二硫鍵彼此共價連接，并且以此抗體重鏈Fc區(qū)多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、 或3、或4、或5)氨基酸序列，和（c)編碼具有C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號的可溶分選酶A的核 酸，
[0039] 并從而生產(chǎn)雙特異性抗體。
[0040] 如本文報道的一個方面是確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0041] (i)確定通過如下方式制備的多種雙特異性抗體的結(jié)合特異性和/或選擇性和/ 或親和力和/或效應(yīng)子功能和/或體內(nèi)半壽期：組合（a)第一多種抗體Fab，或scFab片段， 或scFv抗體片段的每個成員，以此每個成員在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列 LPXTG(SEQ ID N0:01，其中X可以是任何氨基酸殘基）、后接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號KDEL(SEQ ID 勵:02)，以此？&13，或8〇?313片段，或8〇?￥抗體與第一表位或抗原特異性結(jié)合，與〇3)多種包 含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈Fe區(qū)多肽的單臂抗體片段的每個成員，以此全 長抗體重鏈和全長抗體輕鏈?zhǔn)潜舜嘶パa(bǔ)的同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成 與第二表位或抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)，以此全長抗體重鏈和抗體重鏈Fe區(qū)多肽 通過形成抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且以此抗體重鏈Fe區(qū)多肽在 其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，通過分選酶A催化的酶促反 應(yīng)共價連接，
[0042] 和
[0043] (ii)選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應(yīng)子功能和 /或體內(nèi)半壽期的雙特異性抗體并且因而確定抗原結(jié)合位點(diǎn)的組合。
[0044] 在全部方面的一個實(shí)施方案中分選酶A是金黃色葡萄球菌（S. aureus)的分選酶 A。在一個實(shí)施方案中編碼（可溶的）具有C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號的分選酶A的核酸編碼 SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52的氨基酸序列。
[0045] 如本文報道的一個方面是通過本文報道的方法獲得的雙特異性抗體。
[0046] 如本文報道的一個方面是在其重鏈之一中包含氨基酸序列LPXTG(SEQ ID N0:01， 其中X可以是任何氨基酸殘基）的雙特異性抗體。