源自病毒蛋白的肽用作免疫原和配藥成分的制作方法
【專利說明】源自病毒蛋白的肽用作免疫原和配藥成分 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于包括HCV、HIV、HPV、CMV和流感感染在內(nèi)的病毒感染和不同癌癥 和炎性疾病的治療、診斷和預(yù)后的新肽和方法。本發(fā)明還涉及鑒定和提供用于治療和診斷 的肽的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 疫苗開發(fā)的常規(guī)途徑已經(jīng)使用被減毒的完整的有復(fù)制能力的病毒（例如薩賓脊 髓灰質(zhì)炎疫苗（Sabin polio vaccine)，麻瘆，流行性聰腺炎，風(fēng)瘆（MMR))或無復(fù)制能力的 滅活病毒體。有時(shí)，滅活的病毒疫苗可以包括裂解疫苗，其中病毒顆粒已被破壞。也已經(jīng)使 用分子技術(shù)來開發(fā)亞單位疫苗（例如乙型肝炎疫苗），其僅由乙型肝炎病毒的表面糖蛋白 組成。滅活病毒疫苗趨于誘導(dǎo)針對(duì)所討論病毒的原發(fā)性抗體應(yīng)答，然而活的減毒疫苗因?yàn)?所述疫苗誘導(dǎo)瞬時(shí)感染而既誘發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，也誘發(fā)抗體應(yīng)答。
[0004] 利用成功的疫苗接種計(jì)劃已經(jīng)消除的唯一的疾病是天花（smallpox)。目前的計(jì)劃 是繼續(xù)根除脊髓灰質(zhì)炎?？梢酝ㄟ^疫苗接種消除的病毒感染的特征是由具有穩(wěn)定病毒抗原 (即非常低的突變頻率，較少的亞型）的，在其它動(dòng)物物種中缺少儲(chǔ)存池（reservoir)的病 毒引起的感染，一旦感染結(jié)束不在體內(nèi)持續(xù)的病毒引起的感染（其中疫苗接種導(dǎo)致長效的 免疫）。病毒諸如脊髓灰質(zhì)炎和麻瘆滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，然而其蛋白序列改變的病毒諸如流感病 毒（Flu)，HCV，和HIV不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。由于這個(gè)原因，需要開發(fā)用于這些疾病的疫苗的新 的和替代的方法。
[0005] 疫苗接種目的在于在感染之前刺激針對(duì)特定病原體的免疫應(yīng)答。當(dāng)個(gè)體暴露于該 病原體時(shí)，引發(fā)記憶應(yīng)答，其阻止感染的建立。因此疫苗刺激適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其與天然免 疫不同，是持久的并具有記憶。對(duì)于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)存在兩個(gè)主要方式。體液免疫，其包括 產(chǎn)生結(jié)合病毒顆粒的抗體和某些能夠中和感染的抗體。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，其導(dǎo)致發(fā)展細(xì)胞 毒性T細(xì)胞，在I類人白細(xì)胞抗原（HLA)的情形中，其殺死暴露病毒表位的感染細(xì)胞，以這 種方式清除感染的細(xì)胞。
[0006] 提供適于刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的疫苗的挑戰(zhàn)在于肽表位需要被抗原呈遞細(xì)胞攝 取。
[0007] 已經(jīng)證明一些肽通過似乎是能量不依賴性途徑穿過真核細(xì)胞的質(zhì)膜易位。這些肽 被定義為細(xì)胞穿透肽（CPPs)。與常規(guī)技術(shù)相比，使用這些細(xì)胞穿透肽進(jìn)行細(xì)胞遞送提供一 些優(yōu)勢(shì)。其是非侵入性的、能量不依賴性的，有效用于寬泛范圍的細(xì)胞類型，并且可以一齊 (en masse)用于細(xì)胞。
[0008] 對(duì)于體液應(yīng)答和產(chǎn)生抗體，由于B-細(xì)胞的刺激也由胞外肽抗原進(jìn)行，可以不需要 獲得細(xì)胞穿透性質(zhì)。肝炎意指肝臟炎癥，可由多種因素引起，包括由毒素、某些藥物、一些疾 病、酗酒和細(xì)菌感染與病毒感染引起。肝炎還是影響肝臟的病毒感染家族的名稱；發(fā)達(dá)國家 中最常見的類型是甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎。
[0009] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV)感染導(dǎo)致的肝病。其嚴(yán)重性范圍可以從持續(xù)幾 周的輕微疾病到嚴(yán)重的、終生的疾病。丙型肝炎通過血液傳播；最常見的傳播形式是通過共 用針具或其他用于注射藥物的器具。感染可以是"急性的"或"慢性的"。急性HCV感染是 在某人暴露于丙型肝炎病毒后前6個(gè)月內(nèi)發(fā)生的無臨床癥狀的、短期的疾病。對(duì)于大部分 人，急性感染引起慢性感染，其可導(dǎo)致長期的并發(fā)癥，甚至死亡。
[0010] HCV是包膜正鏈核糖核酸（RNA)病毒，直徑約50nm，屬于黃病毒科（Flaviviridae) 肝炎病毒屬（Hepacivirus)，其在感染的細(xì)胞的胞質(zhì)中復(fù)制。唯一已知的HCV儲(chǔ)蓄池是人， 盡管該病毒在實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)傳播給黑猩猩。HCV的天然靶標(biāo)是肝細(xì)胞，和可能的B淋巴細(xì)胞。 到2008年，已知該病毒六種不同的基因型和超過100種的亞型。復(fù)制通過缺乏校正功能的 RNA-依賴型RNA聚合酶發(fā)生，這導(dǎo)致非常高的突變率。在HCV基因組編碼包膜蛋白的高變 區(qū)中的快速突變?cè)试S該病毒逃避宿主的免疫監(jiān)視。結(jié)果，大部分感染HCV的人發(fā)展成了慢 性感染。
[0011] 估計(jì)全世界有一億七千萬人感染了 HCV，等于全球人口的大約3%。每年還大約有 3-4百萬人感染；估計(jì)這些新感染的患者中有80%發(fā)展成慢性感染。
[0012] HCV的6種基因型具有不同的地理分布。該疾病在早期階段一般是無臨床癥狀的； 大部分患有慢性感染的患者最終發(fā)展成并發(fā)癥，諸如肝纖維化和肝硬化，并且在1-5%的病 例中，發(fā)展成肝細(xì)胞癌。
[0013] HCV是世界上非甲型、非乙型肝炎的主要病因。急性HCV感染常常引起慢性肝炎 和末期肝硬化。估計(jì)多至20%的HCV慢性攜帶者可在大約20年的時(shí)間期間內(nèi)發(fā)展成肝硬 化，并且患有肝硬化的那些中有1-4%有發(fā)展肝癌的危險(xiǎn)。
[0014] 約9. 6kb的HCV病毒單鏈RNA基因組包含Y -和:V -非編碼區(qū)（NCRs)，并且， 在這些NCRs之間，是編碼約3000個(gè)氨基酸的HCV聚蛋白的約9kb的單一長開放閱讀框。
[0015] HCV多肽通過所述開放閱讀框的翻譯和共翻譯蛋白酶解加工產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)蛋白來 源于氨基端四分之一的編碼區(qū)，并且包括衣殼或核心蛋白（約21kDa)，El包膜糖蛋白（約 35kDa)和E2包膜糖蛋白（約70kDa，之前稱為NS1)和p7(約7kDa)。E2蛋白可能以在C端 融合或不融合p7蛋白而存在（Shimotohno等，1995)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在核心區(qū)中的可變開放閱 讀框（alternative reading frame)，其編碼并且表達(dá)稱為F (Frameshift)蛋白的約17kDa 的蛋白（Xu等，2001 ;0u & Xu，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)US2002/0076415)。在相同區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了 關(guān)于其他 14-17kDa 的 ARFPs(可變閱讀框蛋白（Alternative Reading Frame Proteins)) (即，Al至A4)的ORFs，并且在慢性感染的患者的血清中檢測(cè)到針對(duì)至少A1、A2和A3的抗 體（Walewski等，2001)。從HCV編碼區(qū)的其余部分，產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)性HCV蛋白，其包括NS2 (約 23kDa)、NS3 (約 70kDa)、NS4A (約 8kDa)、NS4B (約 27kDa)、NS5A (約 58kDa)和 NS5B (約 68kDa) (Grakoui 等，1993)。
[0016] 流感仍然為世界上死亡和發(fā)病的主要原因。世界衛(wèi)生組織（WHO)估計(jì)季節(jié)性流行 病每年影響3-5百萬患有嚴(yán)重疾病的人，并且導(dǎo)致250, 000-500, 000例死亡。流感是由正 粘病毒科（Orthomyxoviridae)的病毒引起的，其為負(fù)鏈RNA病毒。流感病毒以三種類型存 在：甲、乙和丙型，其中只有甲型與流感流行相關(guān)。發(fā)現(xiàn)甲型病毒存在于人和動(dòng)物中，特別是 鳥類中，但也存在于其他哺乳動(dòng)物如豬中。甲型病毒依據(jù)病毒表面蛋白的不同種類和組合 進(jìn)一步分型為亞型。在多個(gè)亞型中，在2009年，甲型流感（HlNl)亞型和甲型流感（H3N2) 亞型在人中傳播。甲和乙型流感包括在季節(jié)性疫苗中，而丙型流感很少發(fā)生，因此不包括在 季節(jié)性疫苗中。乙型病毒是人特異性的，丙型病毒引起非常輕微的疾病。正粘病毒科的基 因組是分區(qū)段的。甲和乙型流感病毒具有8個(gè)區(qū)段，而丙型具有七個(gè)區(qū)段。流行病可能是 由于當(dāng)兩個(gè)不同的甲型病毒感染同一細(xì)胞時(shí)基因區(qū)段的重排而引起。在人群中沒有針對(duì) 這種新型的重排病毒的免疫。在二十世紀(jì)發(fā)生了三次流感流行：1918年的"西班牙流感"， 1957年的"亞洲流感"和1968年的"香港流感"。1918年的流感流行在世界范圍內(nèi)致使估 計(jì)四千萬-五千萬人死亡。后續(xù)的流感流行要輕得多，1957年估計(jì)有兩百萬例死亡，1968 年有一百萬例死亡。2009年6月，WHO宣布由流感病毒HlNl(豬流感）引起的流行病，在 2010年8月宣布其結(jié)束。
[0017] 人乳頭狀瘤病毒由乳頭狀瘤病毒科（Papillomaviridae)的一組DNA病毒構(gòu)成，其 感染皮膚和黏膜。來源于100種不同的已鑒定的亞型的兩組是主要的臨床關(guān)注病因：引起 疣的那些（良性的和生殖器疣），和一組可以導(dǎo)致宮頸癌的12種"高危險(xiǎn)性"亞型。后一組 已經(jīng)歸因?yàn)榘l(fā)生幾乎所有類型的宮頸癌的作用因素。在世界范圍內(nèi)，宮頸癌保持為婦女的 第二大常見惡性病，并且是發(fā)展中國家中女性癌癥相關(guān)的死亡的主要原因 。HPV 16和18已 經(jīng)主要與宮頸癌相關(guān)，然而，該病毒也是男性和女性中喉癌的病因。HPV通過接觸傳播，并且 通過擦傷（abraisions)進(jìn)入皮膚。僅有早期蛋白表達(dá)的無效感染（abortive infection) 與癌癥發(fā)生相關(guān)。
[0018] 發(fā)明目的
[0019] 本發(fā)明實(shí)施方案的一個(gè)目的是提供可以用作免疫原在受試者中刺激適應(yīng)性免疫 應(yīng)答的肽。
[0020] 本發(fā)明實(shí)施方案的進(jìn)一步目的是提供肽（包括多聚體肽，比如二聚體肽），所述肽 可以用作免疫原以刺激受試者中的體液免疫。
[0021] 尤其，本發(fā)明實(shí)施方案的目的是提供這樣的肽：所述肽可以被抗原呈遞細(xì)胞（巨 噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞）攝取，以使所述肽內(nèi)的表位被正確地加工并呈遞到T淋巴細(xì)胞，從而刺 激有效的免疫應(yīng)答。
[0022] 本發(fā)明實(shí)施方案的進(jìn)一步目的是提供肽（包括多聚體肽，比如二聚體肽），所述肽 包含刺激B淋巴細(xì)胞系（B-細(xì)胞）的細(xì)胞分泌針對(duì)該抗原的抗體的抗原表位。
[0023] 由根據(jù)本發(fā)明的肽提供的B-細(xì)胞活化可以是T細(xì)胞非依賴性的和T細(xì)胞依賴性 的。因此，根據(jù)本發(fā)明的肽或其部分可以與B-細(xì)胞受體相互作用以通過T輔助細(xì)胞依賴或 不依賴的方式活化B-細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生特異抗體。此外，所述肽可以被抗原呈遞細(xì)胞（巨噬 細(xì)胞和/或樹突細(xì)胞）攝取，從而肽內(nèi)的表位被正確加工和呈遞于T-淋巴細(xì)胞，比如輔助 T細(xì)胞，其相應(yīng)幫助活化B細(xì)胞從而刺激有效的免疫應(yīng)答。所述肽還可以由活化的B-細(xì)胞 攝取，其也可以用作抗原呈遞細(xì)胞。肽與B-細(xì)胞通過B-細(xì)胞受體相互作用并隨后內(nèi)化入 細(xì)胞。肽內(nèi)的表位將被加工和呈遞到T-淋巴細(xì)胞比如輔助細(xì)胞。
[0024] 然而，在本發(fā)明的一些重要方面中，根據(jù)本發(fā)明的肽被設(shè)計(jì)為不有效穿透并被抗 原呈遞細(xì)胞攝取。因此，在本發(fā)明的這些方面，根據(jù)本發(fā)明的肽可以提供通過在細(xì)胞表面 通過B-細(xì)胞受體的相互作用的B-細(xì)胞活化。要理解，為了提供持久的B-細(xì)胞刺激，優(yōu)選 根據(jù)本發(fā)明肽被設(shè)計(jì)為包含輔助表位，所述輔助表位可以被抗原呈遞細(xì)胞攝取，從而刺激 CD4+T-輔助細(xì)胞，其可以維持受試者中的有效體液免疫。
[0025] 此外，本發(fā)明實(shí)施方案的目的是提供可以用作抗原的肽，提供用于在受試者中誘 導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物和方法。
[0026] 進(jìn)一步地，本發(fā)明實(shí)施方案的目的是提供可以用作可以用作診斷測(cè)定中的靶標(biāo)抗 原的肽。
[0027] 發(fā)明概述
[0028] 本發(fā)明涉及促進(jìn)針對(duì)在該肽設(shè)計(jì)內(nèi)含有的抗原的體液免疫應(yīng)答的有效活化的肽 設(shè)計(jì)，以及涉及促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞）攝取肽表位以使在I和II類 HLA的情形中所述表位可以被正確加工和呈遞從而刺激CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞兩者的肽設(shè) 計(jì)。具有細(xì)胞毒性能力的CD8+T淋巴細(xì)胞將殺死攜帶目的表位的已感染細(xì)胞。CD4+T淋巴 細(xì)胞提供'幫助'以保持有效的CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。
[0029] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肽構(gòu)建體-具有特定模式或支架設(shè)計(jì)的氨基酸序列，并且尤 其是該設(shè)計(jì)的多聚體肽，比如二聚體肽-具有響應(yīng)這些肽的施用有效受試者中引起體液免 疫應(yīng)答的能力。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的肽構(gòu)建體可以被設(shè)計(jì)為能夠附著或結(jié)合于細(xì)胞表面。所述肽構(gòu)建體 或其部分可以隨后被抗原呈遞細(xì)胞（比如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞）攝取并刺激輔助T-細(xì)胞 從而引起有效和長效T-細(xì)胞依賴性B-細(xì)胞活化。備選地，B-細(xì)胞自身可以提供誘導(dǎo)以幫 助活化B-細(xì)胞。
[0031] 因此根據(jù)本發(fā)明的肽可以穿透細(xì)胞并可以用于以可以被巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞呈 遞的免疫學(xué)有效量的肽或該肽的片段負(fù)載細(xì)胞。因此，這些肽構(gòu)建體可以引起細(xì)胞毒性 T-淋巴細(xì)胞免疫（CTL)應(yīng)答和/或體液免疫應(yīng)答。
[0032] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，肽構(gòu)建體-具有特定的模式或支架設(shè)計(jì)的氨基酸序列-具有 有效穿透細(xì)胞膜的能力。因此，本發(fā)明所述的肽構(gòu)建體可以用于以能夠被巨噬細(xì)胞和樹突 細(xì)胞呈遞的免疫原性有效量的肽或該肽的片段負(fù)載細(xì)胞。因此，這些肽構(gòu)建體可以激發(fā)細(xì) 胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫（CTL)應(yīng)答和/或體液免疫應(yīng)答。
[0033] 因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的單體肽，所述單體肽包含以下結(jié)構(gòu)
[0034] (Z1-Z2)「Z3- (Z4-Z5) 2-Z6- (Z7-Z8) 3-Z9- (Z10-Zn) 4-Z12 (式 I)
[0035] 其中ZSZ4,和任選的Z7和Z 1(1限定任選的后面是甘氨酸（G)或丙氨酸（A)的一個(gè)、 兩個(gè)、或三個(gè)精氨酸殘基或其衍生物的線性序列；Z 2，Z5, Z8和Z 11限定選自半胱氨酸（C)，賴 氨酸（K)，天冬氨酸（D)，天冬酰胺（N)，谷氨酸（E)，谷氨酰胺（Q)，2, 3-二氨基丙酸（Dpr)， 色氨酸（W)，或酪氨酸⑴或其衍生物的任選的氨基酸；Z3,和任選的Z 6, Z9和Z 12限定任意 化學(xué)部分，比如線性氨基酸序列。
[0036] 應(yīng)該理解，除非另有指示，式I的氨基酸序列是指以標(biāo)準(zhǔn)的N-至C-端方向存在的 肽序列，其中提及的第一個(gè)氨基酸是可具有氨基（-NH 2)基團(tuán)或備選地-NH3+基團(tuán)的N-端氨 基酸。提及的最后一個(gè)氨基酸是可具有游離的羧基（-COOH)或羧基化基團(tuán)的C端氨基酸。 在一些實(shí)施方案中，N-和/或C-端氨基酸被修飾，諸如通過N端乙?；駽-端酰胺化修 飾。式I中所用的符號(hào)是指標(biāo)準(zhǔn)的肽鍵，諸如以M-Z 2"表示Z1和Z2之間的標(biāo)準(zhǔn)肽鍵。
[0037] 進(jìn)一步要理解，根據(jù)本發(fā)明的肽主要意為合成的肽合成，其優(yōu)選對(duì)于短于60個(gè)氨 基酸的肽。然而，如果肽由重組方法生產(chǎn)，所述肽可以長于60個(gè)氨基酸。
[0038] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的肽不是由表1或表2任一項(xiàng)中限定的式II的X1-X 5 組成的分離的肽。
[0039] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的肽不是由表8中限定的式III的X1-X6組成的分離 的肽。
[0040] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的肽不是表8中限定的分離的多聚體肽，比如二聚 體肽。
[0041] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及二聚體肽，所述二聚體肽包含兩個(gè)肽單體，其中 各個(gè)肽單體為根據(jù)本發(fā)明所述的。
[0042] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及組合物，所述組合物包含選自根據(jù)本發(fā)明的單 體肽，和根據(jù)本發(fā)明的分離的多聚體肽的兩個(gè)以上的化合物。
[0043] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及分離的核酸或多核苷酸，所述分離的核酸或多 核苷酸編碼根據(jù)本發(fā)明的肽。
[0044] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及載體，所述載體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的肽的核 酸或多核苷酸。
[0045] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含含有編碼根據(jù)本 發(fā)明的肽的核酸或多核苷酸的載體。
[0046] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含根 據(jù)本發(fā)明的至少一個(gè)單體肽，根據(jù)本發(fā)明分離的多聚體肽，肽組合物，核酸或多核苷酸，或 載體；其與藥學(xué)可接受的稀釋劑或賦形劑和任選的免疫佐劑組合。在一些實(shí)施方案中，該免 疫原性組合物是疫苗組合物形式。
[0047] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法， 所述方法包括施用本發(fā)明的至少一種單體肽，分離的多聚體肽，肽組合物，核酸或多核苷 酸，或載體，或組合物。
[0048] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及降低和/或延遲疾病抗原諸如感染原在感染有 所述感染原或患有由所述抗原引起的所述疾病的受試者中的病理作用的方法，所述方法包 括施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的至少一種單體肽，分離的多聚體肽，肽組合物，核酸或多核苷 酸，或載體，或組合物。
[0049] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽用作藥物。
[0050] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽用于治療感染有所述 病毒的受試者中的病毒的病理作用。
[0051] 在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及選自根據(jù)本發(fā)明的單體肽，和根據(jù)本發(fā)明的分 離的多聚