糖蛋白激素長(zhǎng)效超激動(dòng)劑的制作方法
【專利說明】糖蛋白激素長(zhǎng)效超激動(dòng)劑 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明大體涉及具有超激動(dòng)劑活性的修飾糖蛋白激素，以及其在治療與糖蛋白激 素活性相關(guān)的病癥中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及修飾糖蛋白分子，其相比野生型α亞 單位而言在α亞單位包含氨基酸取代和一個(gè)或多個(gè)插入的肽，其中該修飾分子相比野生 型糖蛋白顯示增強(qiáng)的藥理學(xué)性質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002] 促性腺素促濾泡素（促卵泡激素，F(xiàn)SH)和絨毛膜促性腺素（CG)、促黃體激素 (黃體化激素，LH)和促甲狀腺素（甲狀腺刺激激素，TSH)構(gòu)成糖蛋白激素家族。各激 素為兩個(gè)非共價(jià)連接的亞單位，即α和β亞單位的雜二聚體。在相同的物種，α-亞 單位的氨基酸序列在所有激素中都相同，而β-亞單位的序列是激素特異性的（Pierce， Ann. Rev. Biochem. 50:465-495 (1981))。從魚到哺乳動(dòng)物所述亞單位的序列是高度保 守的，該事實(shí)暗示這些激素都是由共同的祖先蛋白進(jìn)化而來的（Fontaine，Gen. Comp. Endocrinol. 32:341-347(1977))。
[0003] 之前關(guān)于修飾糖蛋白激素的研宄已顯示令人鼓舞的數(shù)據(jù)。例如，除了提供具有增 加活性的修飾糖蛋白激素之外，進(jìn)一步的突變已顯示了受體親和結(jié)合的增加（參見例如WO 2005/089445和WO 2005/101000)。然而，盡管親和力增加，研宄證明了修飾糖蛋白激素的 清除即使不快于它們的野生型對(duì)應(yīng)物，也與它們的野生型對(duì)應(yīng)物一樣快。為產(chǎn)生具有增強(qiáng) 活性的臨床有用的超激動(dòng)劑，修飾糖蛋白超激動(dòng)劑除了具有改善的受體結(jié)合親和力之外， 還應(yīng)具有改善的生物半衰期。然而，之前進(jìn)一步修飾糖蛋白激素以增加半衰期和提高生物 利用度的嘗試不太令人滿意，且相反修飾糖蛋白激素僅證明了減弱的反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明包括修飾糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亞單 位的Q13、Ε14、Ρ16或Q20具有至少一個(gè)保守堿性氨基酸取代且在D3和Q5之間具有 VNVTINVT(SEQ ID Ν0:20)的插入片段。
[0005] 在一些實(shí)施方案中，該修飾糖蛋白激素在Q13、Ρ16和Q20包含至少兩個(gè)或至少三 個(gè)堿性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，該修飾糖蛋白激素還在Ε14包含堿性氨基酸取代。 在一些實(shí)施方案中，該堿性氨基酸為精氨酸。
[0006] 在一些實(shí)施方案中，所述α亞單位包含與SEQ ID NO: 11具有至少85%同一性的 氨基酸序列且進(jìn)一步包含黃體化激素（LH)的β亞單位、絨毛膜促性腺素（CG)的β亞單 位、促卵泡激素（FSH)的β亞單位或甲狀腺刺激激素（TSH)的β亞單位。在一些實(shí)施方 案中，所述α亞單位衍生自人α亞單位（SEQ ID Ν0:6)。
[0007] 本發(fā)明包括修飾糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亞單位的 Κ15、Κ17、Κ20或Κ24具有至少一個(gè)保守堿性氨基酸取代且在F6和Τ7之間具有NVTINV (SEQ ID NO: 1)的插入片段。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，修飾糖蛋白激素在K15、K17、K20和K24包含至少兩個(gè)、或至少 三個(gè)或至少四個(gè)堿性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，該修飾糖蛋白激素進(jìn)一步在Ε18包 含堿性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，該堿性氨基酸為精氨酸。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，所述α亞單位包含與SEQ ID ΝΟ:7具有至少85%同一性的 氨基酸序列且進(jìn)一步包含黃體化激素（LH)的β亞單位、絨毛膜促性腺素（CG)的β亞單 位、促卵泡激素（FSH)的β亞單位或甲狀腺刺激激素（TSH)的β亞單位。在一些實(shí)施方 案中，所述α亞單位衍生自牛、豬或綿羊的α亞單位（分別為SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO:3)〇
[0010] 本發(fā)明包括修飾糖蛋白激素，其包含的氨基酸序列在糖蛋白激素的α亞單位的 Κ15、Ε18、Κ20或Κ24具有至少一個(gè)保守堿性氨基酸取代，且在F6和Τ7之間具有NVTINV (SEQ ID NO: 1)的插入片段或具有在F6和Τ7之間NV的插入片段加上Τ7和Τ8之間INV的插入 片段。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，修飾糖蛋白激素在K15、E18、K20和K24包含至少兩個(gè)、或至少 三個(gè)或至少四個(gè)堿性氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，所述修飾糖蛋白激素在所述α亞單 位的F6和Τ7之間包含NVTINV(SEQ ID NO: 1)的插入片段。在一些實(shí)施方案中，所述修飾 糖蛋白激素包含在所述α亞單位的F6和T7之間NV的插入片段加上T7和T8之間INV的 插入片段。在一些實(shí)施方案中，該堿性氨基酸為精氨酸或組氨酸。在一些實(shí)施方案中，該堿 性氨基酸為精氨酸。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，所述α亞單位包含與SEQ ID Ν0:4具有至少85%同一性的 氨基酸序列且進(jìn)一步包含黃體化激素（LH)的β亞單位、絨毛膜促性腺素（CG)的β亞單 位、促卵泡激素（FSH)的β亞單位或甲狀腺刺激激素（TSH)的β亞單位。在一些實(shí)施方 案中，所述α亞單位衍生自馬的α亞單位（SEQ ID NO:4)。
[0013] 本發(fā)明還包括刺激動(dòng)物糖蛋白受體的方法，包括向動(dòng)物給藥上述修飾糖蛋白激 素。本發(fā)明還包括刺激動(dòng)物排卵的方法，包括向動(dòng)物給藥上述任一種修飾糖蛋白激素。在 一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為人、牛、羊（sheep)、豬或馬。
[0014] 附圖簡(jiǎn)述
[0015] 圖1顯示用通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染制備的所選的bFSH類似物在CHO-FSHR細(xì)胞中的cAMP 刺激。圖IA顯示Folltropin?-V (pFSH)、bFSH-WT (野生型）與bFSH-5R類似物的比較。 圖IB顯示通過兩個(gè)N-端延伸物（ANITV，NITV)和一個(gè)內(nèi)部新糖基化（V78N) (SPA cAMP測(cè) 試）對(duì)hFSH-TR4402類似物（瞬時(shí)4402)的體外生物活性的減弱。圖IC顯示bFSH-5R類 似物與插入片段1(5R+插入片段1)和插入片段2 (5R+插入片段2)的比較。
[0016] 圖2A和2B顯示小鼠單一皮下注射后多種bFSH類似物的PK篩選測(cè)試。在各實(shí)驗(yàn) 中，5只小鼠用于各制備物。血樣在注射后24、32和48小時(shí)采集，扣除血漿水平且數(shù)據(jù)表示 為注射劑量的％ ID)。血漿樣品中FSH水平使用FSH ELISA (Endodrine Technologies) 測(cè)試。
[0017] 圖3A-D顯示TR55601產(chǎn)生的不同批次（lot)的分析。圖3A顯示電荷異質(zhì)性分 析，其使用IEF然后是蛋白質(zhì)印跡。批次3 (泳道2和3)的次優(yōu)唾液酸化作用（Suboptimal sialylation)顯然不同于批次4(泳道5和6)中檢測(cè)的最優(yōu)高度酸性亞型。泳道1，IEF 3-10 標(biāo)記；泳道 2, TR55601/ 批次 3(8 μ g);泳道 3, TR55601/ 批次 3(4 μ g);泳道 4 和 8， TR4401(lyg);泳道 5, TR55601/批次 4(8yg);泳道 6, TR55601/批次 4(4yg);泳道 8， IEF 3-10標(biāo)記。圖3B顯示使用神經(jīng)氨酸酶（霍亂弧菌）、IEF和蛋白質(zhì)印跡的帶電荷的 亞型的分析。未處理的TR55601/批次4樣品（泳道2和3)和TR55601/批次4樣品用神 經(jīng)氨酸酶處理，然后施加至3-10IEF凝膠（泳道4-6)。泳道1，IEF 3-10標(biāo)記；泳道2,未 處理的TR55601/批次4(8yg);泳道3,未處理的TR55601/批次4(4yg);泳道4,處理的 TR55601/批次4 (4 μ g);泳道5,處理的TR55601/批次4 (2 μ g);泳道6,處理的TR55601/批 次4(1 yg)。神經(jīng)氨酸酶消化的亞型的IEF曲線已位移至7. 8至10. 0的pi范圍。pi的平均 位移為約5pH單位且多個(gè)帶（接近10個(gè)帶）轉(zhuǎn)化為一個(gè)主要帶（pi?9. 5)和三個(gè)次要帶 (pi 7. 8-10. 0)，這表明大多數(shù)觀察到的電荷異質(zhì)性（圖3A-批次4)依賴于末端唾液酸殘 基以及占較少組成的其它修飾如脫酰胺化和/或蛋白水解降解。3B所示的殘余堿基帶（pi 4. 8-5. 5)為非特異性的，衍生自神經(jīng)氨酸酶制備。圖3C顯示TR55601-批次5的帶電荷的 亞型的分析，其通過在Pl梯度凝膠（IEF 3-10)中的IEF3-10,然后通過蛋白質(zhì)印跡。泳道 1，IEF 3-10 標(biāo)記；泳道 2，TR55601-批次 5(4yg);泳道 3，TR55601-批次 5(4yg);泳道 4， TR55601-批次 4 (4 μ g);泳道 5, TR55601-批次 4 (8 μ g);泳道 6, TR55601-批次 3 (4 μ g); 泳道7, TR55601-批次3 (8 μ g)。圖3D顯示TR55601批次5的SDS-蛋白質(zhì)印跡分析，其與 TR55601批次4和Fol-V比較。泳道1，蛋白質(zhì)標(biāo)記；泳道2:批次4,500ng;泳道3:批次5， Iul ;泳道4:空泳道；泳道5:批次4,4ug ;泳道6:批次5,15ul ;泳道7:Fol-V，673ng ;泳道 8:蛋白質(zhì)標(biāo)記。
[0018] 圖4顯示在不成熟（22天齡）Sprague-Dawley雌性大鼠中對(duì)于卵巢重量的hCG增 加的經(jīng)典Steelman-Pohley生物測(cè)定的結(jié)果。在給藥后72小時(shí)測(cè)量卵巢重量。數(shù)據(jù)表示 為兩個(gè)卵巢的平均總卵巢重量+SEM(每次給藥每組η = 5)。大鼠用補(bǔ)充有40IU hCG的測(cè) 試制品或媒介物的一次單一注射刺激。使用以下劑量組：組1僅接受hCG(無 FSH)，組2-5 接受TR55601批次4 (分別為0. 33 μ g，I. 0 μ g，3. 33 μ g，和10 μ g，從左至右），組6-8接受 Fo丨丨tropin-V? (分別為 3, 333 μ g，10, 000 μ g，and 30, 000 μ g，從左至右），且組 9-10 接 受 TR4401 (I. 0 μ g 和 3. 33 μ g)。
[0019] 圖5顯示超數(shù)排卵、誘導(dǎo)排卵和固定時(shí)間人工受精的卵泡波同步方案。 Folltropin-VR(Bioniche)的8次注射用單次或雙次注射TR55601代替。
[0020] 圖6顯示在肉用母牛（beef cow)的超刺激處理過程中卵泡（直徑3至5mm)的平 均數(shù)，其用60 μ g rFSH單一肌內(nèi)注射給藥，或每天兩次肌內(nèi)注射300mg Folltropin-V (對(duì) 照）給藥，歷經(jīng)4天（組合3個(gè)實(shí)驗(yàn)）。
[0021] 圖7顯示在肉用母牛的超刺激處理過程中卵泡（直徑6至8mm)的平均數(shù)，其用 60 μ g rFSH單一肌內(nèi)注射給藥，或每天兩次肌內(nèi)注射300mg Folltropin-V (對(duì)照）給藥，歷 經(jīng)4天（組合3個(gè)實(shí)驗(yàn)）。
[0022] 圖8顯示在肉用母牛的超刺激處理過程中卵泡（直徑>9mm)的平均數(shù)，其用60 μ g rFSH單一肌內(nèi)注射給藥，或每天兩次肌內(nèi)注射300mg FoI Itropin-V (對(duì)照）給藥，歷經(jīng)4天 (組合3個(gè)實(shí)驗(yàn)）。
[0023] 圖9顯示在肉用母牛的超刺激處理過