用于非期望核酸序列的陰性選擇的組合物和方法
【專利說(shuō)明】用于非期望核酸序列的陰性選擇的組合物和方法 奪叉引用
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年6月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/661，293的優(yōu) 先權(quán)，該臨時(shí)專利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。
【背景技術(shù)】
[0002] 下一代測(cè)序（NGS)文庫(kù)是其核苷酸序列有待測(cè)定的DNA片段的集合。用于插入到 這些文庫(kù)中的DNA的來(lái)源通常為已被片段化為期望長(zhǎng)度的基因組DNA或者來(lái)自給定細(xì)胞群 體的轉(zhuǎn)錄組的拷貝。轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的產(chǎn)生是通過(guò)制備RNA群體的cDNA拷貝，產(chǎn)生每條DNA鏈 的互補(bǔ)鏈，從而生成雙鏈DNA，然后將雙鏈DNA連接至文庫(kù)特異性銜接子進(jìn)行的?？赏ㄟ^(guò)使 用隨機(jī)引物、序列特異性引物或含有寡聚dT尾的引物引發(fā)聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄物群體來(lái)合 成cDNA。常見(jiàn)地，這些片段群體包含并非特定研宄所關(guān)注的DNA，并且在一些情況下，這些 非期望的DNA序列占到整個(gè)DNA群體的非常顯著的百分比。例如，在全轉(zhuǎn)錄組研宄中，在不 存在從樣品中去除rRNA的步驟下，核糖體RNA (rRNA)序列構(gòu)成典型cDNA文庫(kù)中的所有片 段的大多數(shù)（60-90% )。在另一實(shí)例中，來(lái)自外周血的基因表達(dá)概況分析（profiling)主 要涉及來(lái)自外周血單核細(xì)胞（PBMC)的mRNA，PBMC占全血樣品的不到0. 1%。減少來(lái)自占 血液樣品中細(xì)胞的大多數(shù)的紅細(xì)胞的珠蛋白R(shí)NA在此類測(cè)定中是期望的。
[0003] 關(guān)于rRNA去除或排除，已描述了三種通用的方法：1)從起始群體中去除rRNA ;2) 采用寡聚dT引物進(jìn)行差別性引發(fā)（即僅引發(fā)聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄物）；以及3)在與rRNA序 列互補(bǔ)的引物在引物集合體中被特異性消除（或代表不足）的情況下進(jìn)行差別性引發(fā)（非 完全隨機(jī)（Not-So-Random)或NSR引物方法；參見(jiàn)Armour等人，2009)?；谝韵聝蓚€(gè)原 因，用僅識(shí)別poly (A)-序列的引物來(lái)引發(fā)總RNA群體是有問(wèn)題的。首先，其不能用于原核 生物，因?yàn)樵薽RNA在其3'端不含poly (A)-序列。其次，即使對(duì)于真核RNA樣品，許多生 物學(xué)上重要的元件，如調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄物，是未經(jīng)聚腺苷酸化的，因此從寡聚dT引發(fā)的文庫(kù)中 丟失。盡管NSR引發(fā)策略在設(shè)計(jì)用于特定生物體時(shí)可能是有效的，但當(dāng)在更寬范圍的樣品 類型中使用一組優(yōu)化不足的引物時(shí)，NSR引發(fā)可引起樣品群體的失真。
[0004] 需要用于從NGS文庫(kù)中去除特定的非期望DNA片段的改進(jìn)的方法。這樣的方法理 想地會(huì)使得能夠使用無(wú)偏模板群體開始并在產(chǎn)生NGS文庫(kù)后以序列特異性方式消除非期 望的DNA片段。本文所述的發(fā)明滿足了這一需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了用于構(gòu)建NGS文庫(kù)的新的方法、組合物和試劑盒，在該文庫(kù)中非期 望的核酸序列已被排除或大幅度減少。特別地，本發(fā)明的一個(gè)重要方面是允許在產(chǎn)生NGS 文庫(kù)之后以序列特異性方式消除或減少非期望的DNA序列的方法和組合物，在該NGS文庫(kù) 中起始核酸序列群體（例如，轉(zhuǎn)錄組）的所有序列以未失真的、無(wú)偏的方式表現(xiàn)。本發(fā)明的 方法可用于從核酸文庫(kù)中消除非期望的核酸序列，如核糖體RNA，并因此可用于富集文庫(kù)中 的目的核酸序列。
[0006] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種以序列特異性方式從具有單鏈DNA模板的核酸文 庫(kù)中選擇性地去除非期望的核酸序列的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括：a)使一個(gè) 序列特異性寡核苷酸引物或一組序列特異性寡核苷酸引物與在每個(gè)末端附接有固定取向 的銜接子的單鏈DNA模板退火，其中該序列特異性寡核苷酸被設(shè)計(jì)為互補(bǔ)于非期望的核酸 序列或與非期望的核酸序列相鄰的區(qū)域，并且其中兩個(gè)銜接子序列中的一個(gè)包含對(duì)雙鏈 DNA具特異性的限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列；b)用DNA聚合酶將序列特異性引物延伸至 銜接子-DNA模板連接點(diǎn)之外，從而產(chǎn)生雙鏈DNA片段，其中寡核苷酸引物與單鏈DNA模板 互補(bǔ)；c)用對(duì)雙鏈DNA具特異性的限制性內(nèi)切核酸酶處理DNA片段（單鏈的和雙鏈的）的 群體，從而僅在銜接子限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)裂解雙鏈DNA片段，并因此從包含非期望核 酸序列的片段的一個(gè)末端去除銜接子；以及d)使用對(duì)每種銜接子均具有特異性的引物進(jìn) 行PCR，由此僅當(dāng)片段在同一模板上具有兩個(gè)PCR引發(fā)位點(diǎn)時(shí)才發(fā)生指數(shù)式擴(kuò)增，從而僅擴(kuò) 增所期望的核酸序列。
[0007] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于從目的樣品構(gòu)建核酸文庫(kù)、同時(shí)保留無(wú)偏核 酸模板群體的方法，在該無(wú)偏核酸模板群體中起始核酸序列群體的所有序列均得到表現(xiàn)。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于構(gòu)建定向（即鏈特異性）核酸文庫(kù)的 方法，該方法包括：a)對(duì)RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；b)由逆轉(zhuǎn)錄的RNA樣品產(chǎn)生雙鏈CDNA，其中 在第二鏈cDNA合成中，將至少一種修飾的核苷酸沿cDNA的第二鏈的長(zhǎng)度摻入該鏈中；c) 對(duì)該雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)；d)將銜接子連接至該雙鏈cDNA，其中兩種銜接子中的一種具 有摻入到該銜接子的連接鏈中的修飾的核苷酸；e)進(jìn)行缺口修復(fù)；f)用合適的降解劑選擇 性地去除cDNA的第二鏈；以及g)從樣品中去除降解產(chǎn)物，從而產(chǎn)生有固定取向的銜接子附 接至每一末端的的單鏈DNA模板的文庫(kù)。
[0009] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，摻入CDNA的第二鏈中的修飾的核苷酸是脫氧尿苷三磷酸 (dUTP)，并且降解劑是核酸酶尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG)。
[0010] 在其他實(shí)施方案中，所構(gòu)建的核酸文庫(kù)不是鏈特異性的。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，目的核酸樣品包含總RNA。在一些實(shí)施方案中，目的核酸樣品 使用隨機(jī)引物群體進(jìn)行引發(fā)。在其他實(shí)施方案中，目的核酸樣品使用部分選擇性引物群體 進(jìn)行引發(fā)。
[0012] 在多個(gè)方面，本發(fā)明涉及從核酸集合體中排除非期望的核酸的方法。可用剩余的 核酸制備文庫(kù)。核酸的排除和文庫(kù)的產(chǎn)生可以以鏈特異性方式進(jìn)行。根據(jù)第一方面，本發(fā) 明涉及一種用于從核酸文庫(kù)中排除或減少特定的非期望的核酸序列的方法，該方法包括： (a)產(chǎn)生包含單鏈DNA片段的核酸文庫(kù)，該單鏈DNA片段在每個(gè)DNA片段的每個(gè)末端附接 有固定取向的銜接子；(b)使序列特異性寡核苷酸探針與在每個(gè)末端附接有固定取向的銜 接子的單鏈DNA片段退火，其中該序列特異性寡核苷酸探針被設(shè)計(jì)成與非期望的核酸序列 互補(bǔ)，并且其中兩個(gè)銜接子中的至少一個(gè)包含對(duì)雙鏈DNA具特異性的限制性內(nèi)切核酸酶的 識(shí)別序列；（c)用DNA聚合酶延伸該序列特異性寡核苷酸探針，從而創(chuàng)建包含非期望的核酸 序列的至少一部分的雙鏈DNA片段；（d)用對(duì)雙鏈DNA具特異性的限制性內(nèi)切核酸酶處理 包含雙鏈和單鏈DNA的DNA片段群體，從而在限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)處裂解雙鏈DNA片段； 以及（e)用一組對(duì)銜接子序列具有特異性的引物進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增包含期望的核酸序列 的DNA片段。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的額外步驟。在 一些實(shí)施方案中，該核酸文庫(kù)來(lái)源于分選的細(xì)胞的群體。在一些實(shí)施方案中，該核酸文庫(kù)來(lái) 源于單細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將細(xì)胞分選到多孔板、微陣列、微流體 裝置或載玻片中，由此產(chǎn)生分選的細(xì)胞的群體。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn) 行分選。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分選。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞 大小進(jìn)行分選。在一些實(shí)施方案中，非期望的核酸序列包含細(xì)菌核糖體RNA、線粒體DNA、人 珠蛋白mRNA、人細(xì)胞質(zhì)rRNA、人線粒體rRNA、葡萄細(xì)胞質(zhì)rRNA、葡萄線粒體rRNA或葡萄葉 綠體rRNA。在一些實(shí)施方案中，步驟d的限制性內(nèi)切核酸酶是BspQI。在一些實(shí)施方案中， 該DNA聚合酶包括熱啟動(dòng)聚合酶。在一些實(shí)施方案中，該DNA聚合酶是MyTaq聚合酶。在 一些實(shí)施方案中，步驟（a)包括：i.對(duì)RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；ii.由逆轉(zhuǎn)錄的RNA樣品生成 雙鏈cDNA，其中四種dNTP (即dATP、dCTP、dGTP或dTTP)中的至少一種在第二鏈合成過(guò)程 中被非規(guī)范dNTP所替代，并摻入到第二鏈中；iii.對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)；iv.將銜接 子連接至雙鏈cDNA的5'端，其中銜接子鏈中的一條具有摻入到銜接子的連接鏈中的非規(guī) 范核苷酸；V.進(jìn)行缺口修復(fù)；以及iv.用裂解劑選擇性地去除第二鏈。在一些實(shí)施方案中， 非規(guī)范核苷酸包含尿苷或肌苷。在一些實(shí)施方案中，步驟vi包括裂解一種或多種非規(guī)范核 苷酸的堿基部分，從而形成脫堿基位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，該裂解劑包含糖基化酶。在一 些實(shí)施方案中，該糖基化酶是UNG或UDG。在一些實(shí)施方案中，該裂解劑包含伯胺。在一些 實(shí)施方案中，該裂解劑包含多胺。在一些實(shí)施方案中，該多胺是DMED。在一些實(shí)施方案中， 該裂解劑包含糖基化酶和多胺。在一些實(shí)施方案中，該裂解劑包含內(nèi)切核酸酶V。
[0013] 在第二方面，本發(fā)明涉及一種將銜接子連接至核酸集合體的方法，該方法包括： (a)將包含含有5'磷酸的第一核酸鏈、含有5'磷酸以及一種或多種非規(guī)范核苷酸的第二核 酸鏈的核酸與至少一個(gè)包含缺乏5'磷酸的第一銜接子鏈和缺乏5'磷酸以及一種或多種非 規(guī)范核苷酸的第二銜接子鏈的第一銜接子連接；(b)進(jìn)行3'延伸反應(yīng)；以及（c)用包含一 種或多種裂解試劑的物質(zhì)（agent)進(jìn)行裂解反應(yīng)，從而裂解至少一條包含一種或多種非規(guī) 范核苷酸的核酸鏈；其中所述一種或多種裂解劑中的一種對(duì)包含所述一種或多種非規(guī)范核 苷酸的核酸鏈?zhǔn)翘禺愋缘摹Ｔ谝恍?shí)施方案中，該方法包括將核酸與第二銜接子連接，該第 二銜接子包含缺乏5'磷酸的第三銜接子鏈和缺乏5'磷酸以及一種或多種非規(guī)范核苷酸的 第四銜接子鏈，其中第一和第二銜接子是不同的。在一些實(shí)施方案中，該核酸在每個(gè)末端與 第一或第二銜接子連接。在一些實(shí)施方案中，非規(guī)范核苷酸選自尿嘧啶和肌苷。在一些實(shí)施 方案中，步驟c包括裂解所述一種或多種非規(guī)范核苷酸的堿基部分，從而形成脫堿基位點(diǎn)。 在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種裂解試劑包含糖基化酶。在一些實(shí)施方案中，該糖基化 酶是UNG或UDG。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種裂解試劑包含伯胺。在一些實(shí)施方案 中，所述一種或多種裂解試劑包含多胺。在一些實(shí)施方案中，該多胺是DMED。在一些實(shí)施方 案中，所述一種或多種裂解試劑包含糖基化酶和多胺。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種 裂解試劑包含內(nèi)切核酸酶V。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括進(jìn)行包含第一引物和 第二引物的擴(kuò)增反應(yīng)，從而生成擴(kuò)增產(chǎn)物，其中第一引物可與第一銜接子鏈雜交且第二引 物可與第四銜接子鏈雜交。在一些實(shí)施方案中，第一銜接子包含對(duì)雙鏈DNA具特異性的限 制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括：（d)使探針與第一核 酸鏈上的序列雜交，（e)用DNA聚合酶延伸該探針，從而產(chǎn)生部分雙鏈體核酸，以及（f)用 對(duì)雙鏈DNA具特異性的限制性內(nèi)切核酸酶處理該部分雙鏈體核酸，從而在識(shí)別序列處裂解 雙鏈DNA片段。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括用一組對(duì)銜接子序列具有特異性的 引物進(jìn)行PCR，從而擴(kuò)增核酸集合體中的至少一個(gè)第二核酸。在一些實(shí)施方案中，第二核酸 缺乏步驟d中的序列。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)第二核酸的一部分進(jìn)行測(cè) 序。在一些實(shí)施方案中，所述核酸通過(guò)以下步驟生成：i.在RNA上進(jìn)行第一鏈合成，從而形 成第一鏈合成產(chǎn)物；以及ii.在非規(guī)范核苷酸的存在下在第一鏈上進(jìn)行第二鏈合成，從而 形成第二鏈合成產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括選擇性地裂解RNA。在一些實(shí) 施方案中，選擇性地裂解RNA包括用RNAse H進(jìn)行處理。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步 包括：iii.對(duì)第一和第二鏈合成產(chǎn)物進(jìn)行片段化，從而生成片段化的第一和第二鏈合成產(chǎn) 物；iv.進(jìn)行末端修復(fù)；以及V.進(jìn)行5'磷酸化。在一些實(shí)施方案中，核酸集合體來(lái)源于分 選的細(xì)胞的群體。在一些實(shí)施方案中，核酸集合體來(lái)源于單細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該方 法進(jìn)一步包括將細(xì)胞分選到多孔板、微陣列、微流體裝置或載玻片中，由此產(chǎn)生分選的細(xì)胞 的群體。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行分選。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞 的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分選。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)細(xì)胞大小進(jìn)行分選。在一些實(shí)施方案中，核 酸集合體包含細(xì)菌核糖體RNA、線粒體DNA、人珠蛋白mRNA、人細(xì)胞質(zhì)rRNA、人線粒體rRNA、 葡萄細(xì)胞質(zhì)rRNA、葡萄線粒體rRNA或葡萄葉綠體rRNA。在一些實(shí)施方案中，所述限制性內(nèi) 切核酸酶是BspQI。在一些實(shí)施方案中，使用熱啟動(dòng)聚合酶進(jìn)行3'延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施 方案中，使用MyTaq聚合酶進(jìn)行3'延伸反應(yīng)。
[0014] 在第三方面，本發(fā)明涉及一種進(jìn)行銜接子連接以創(chuàng)建包含期望的和非期望的核酸 的鏈保留核酸文庫(kù)的方法，該方法包括：(a)將模板集合體與各自包含3'突出端的多個(gè)部 分雙鏈體引物混合，該模板集合體包含含有一種或多種非規(guī)范核苷酸的非期望的核酸和含 有一種或多種非規(guī)范核苷酸的期望的核酸；