，加入占發(fā)酵液質(zhì)量12%的鈣基蒙脫石粉進(jìn)行菌體絮凝沉淀，然后采用濾布孔徑為2000目的板框進(jìn)行擠壓過濾，所得濾液通過管式高速離心機(jī)進(jìn)行過濾，轉(zhuǎn)速13000rpm，使菌體和發(fā)酵液徹底分離，獲得除菌發(fā)酵液；
[0042]b、去除雜蛋白:在除菌發(fā)酵液中加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH至3.8，在90°C條件下加熱0.5h，以使雜蛋白沉淀，離心分離，去除雜蛋白沉淀，獲得除蛋白發(fā)酵液；
[0043]c、脫色:向除蛋白發(fā)酵液中加入占除蛋白發(fā)酵液質(zhì)量3%的活性炭在40°C條件下進(jìn)行吸附脫色lh，獲得脫色發(fā)酵液；
[0044]d、去除無機(jī)鹽:將脫色發(fā)酵液進(jìn)入DOOl型陽離子交換樹脂柱，連續(xù)交換，去除除蛋白發(fā)酵液中的鈣、鎂等影響產(chǎn)品純度的無機(jī)鹽，獲得除鹽發(fā)酵液；
[0045]e、結(jié)晶:將除鹽發(fā)酵液進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮至180g/L，然后在濃縮液中加入3倍體積的乙酸，降溫至15°C，結(jié)晶30h，得晶體；
[0046]f、洗滌、烘干:結(jié)晶好的晶體采用無水乙醇進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)行程序升溫真空干燥烘干，真空干燥方法是80°C真空烘干4h，然后升溫至90°C再真空烘干4h，烘干后的晶體采用高效液相色譜法檢測，純度為98.3 %。
[0047]實施例3
[0048]本實施例按實施例2相同的方式對與實施例2相同的原料進(jìn)行分離提純，區(qū)別僅在于步驟b中的溫度由90°C改為70°C，經(jīng)測試本實施中最終產(chǎn)品純度是97.9%，相比于實施例2較差。說明90 0C熱處理效果更好，能夠徹底使發(fā)酵液中的蛋白變性，減少了結(jié)晶液中的雜蛋白，就提高了產(chǎn)品的純度。
[0049]實施例4
[0050]本實施按如下步驟對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行分離提純:
[0051]a、菌液分離:以申請?zhí)枮?01310600843.0的發(fā)明專利所公開的方法中，大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的含N-乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)酵液為原料，加入占發(fā)酵液質(zhì)量16%的鈣基蒙脫石粉進(jìn)行菌體絮凝沉淀，然后采用濾布孔徑為3000目的板框進(jìn)行擠壓過濾，所得濾液通過管式高速離心機(jī)進(jìn)行過濾，轉(zhuǎn)速12000rpm，使菌體和發(fā)酵液徹底分離，獲得除菌發(fā)酵液；
[0052]b、去除雜蛋白:在除菌發(fā)酵液中加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH至4.0，在85°C條件下加熱lh，以使雜蛋白沉淀，離心分離，去除雜蛋白沉淀，獲得除蛋白發(fā)酵液；
[0053]c、脫色:向除蛋白發(fā)酵液中加入占除蛋白發(fā)酵液質(zhì)量4%的活性炭在50°C條件下進(jìn)行吸附脫色0.5h，獲得脫色發(fā)酵液；
[0054]d、去除無機(jī)鹽:將脫色發(fā)酵液進(jìn)入DOOl型陽離子交換樹脂柱，連續(xù)交換，去除除蛋白發(fā)酵液中的鈣、鎂等影響產(chǎn)品純度的無機(jī)鹽，獲得除鹽發(fā)酵液；
[0055]e、結(jié)晶:將除鹽發(fā)酵液進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮至150g/L，然后在濃縮液中加入3倍體積的乙酸，降溫至12°C，結(jié)晶35h，得晶體；
[0056]f、洗滌、烘干:結(jié)晶好的晶體采用無水乙醇進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)行程序升溫真空干燥烘干，真空干燥方法是70°C真空烘干5h，然后升溫至85°C再真空烘干3h，烘干后的晶體采用高效液相色譜法檢測，純度為98.1 %。
[0057]實施例5
[0058]本實施例按實施例4相同的方式對與實施例4相同的原料進(jìn)行分離提純，區(qū)別僅在于不進(jìn)行步驟山本實施例所得最終產(chǎn)品純度97.6%，相比于實施例4較差，說明采用離子交換法去除陽離子鹽，可以提高產(chǎn)品純度。
[0059]實施例6
[0060]本實施按如下步驟對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行分離提純:
[0061]a、菌液分離:以申請?zhí)枮?01310600843.0的發(fā)明專利所公開的方法中，大腸桿菌基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的含N-乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)酵液為原料，加入占發(fā)酵液質(zhì)量18%的鈣基蒙脫石粉進(jìn)行菌體絮凝沉淀，然后采用濾布孔徑為5000目的板框進(jìn)行擠壓過濾，所得濾液通過管式高速離心機(jī)進(jìn)行過濾，轉(zhuǎn)速llOOOrpm，使菌體和發(fā)酵液徹底分離，獲得除菌發(fā)酵液；
[0062]b、去除雜蛋白:在除菌發(fā)酵液中加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH至3.5，在90°C條件下加熱lh，以使雜蛋白沉淀，離心分離，去除雜蛋白沉淀，獲得除蛋白發(fā)酵液；
[0063]c、脫色:向除蛋白發(fā)酵液中加入占除蛋白發(fā)酵液質(zhì)量3%的活性炭在35°C條件下進(jìn)行吸附脫色0.5h，獲得脫色發(fā)酵液；
[0064]d、去除無機(jī)鹽:將脫色發(fā)酵液進(jìn)入DOOl型陽離子交換樹脂柱，連續(xù)交換，去除除蛋白發(fā)酵液中的鈣、鎂等影響產(chǎn)品純度的無機(jī)鹽，獲得除鹽發(fā)酵液；
[0065]e、結(jié)晶:將除鹽發(fā)酵液進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，濃縮至200g/L，然后在濃縮液中加入4倍體積的乙酸，降溫至8°C，結(jié)晶40h，得晶體；
[0066]f、洗滌、烘干:結(jié)晶好的晶體采用無水乙醇進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)行程序升溫真空干燥烘干，真空干燥方法是80°C真空烘干3h，然后升溫至90°C再真空烘干2h，烘干后的晶體采用高效液相色譜法檢測，純度為98.5 %。
[0067]實施例7
[0068]本實施例按實施例6相同的方式對與實施例6相同的原料進(jìn)行分離提純，區(qū)別僅在于:步驟f干燥時不采用真空程序升溫干燥法，僅在90°C恒溫真空干燥6h，本實施例所得最終產(chǎn)品純度97.7%，相比于實施例6較差，說明采用真空程序升溫干燥法可以提高產(chǎn)品純度。
【主權(quán)項】
1.一種對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行分離提純的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行: a、以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)酵液為原料，加入蒙脫石粉進(jìn)行菌體絮凝沉淀，然后采用板框過濾器進(jìn)行粗濾，對所得濾液進(jìn)行離心分離，以去除發(fā)酵液中菌體，獲得除菌發(fā)酵液； b、在所述除菌發(fā)酵液中加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH至3.0?5.0，再在80?90°C條件下加熱處理，以使雜蛋白沉淀，離心分離，去除雜蛋白沉淀，獲得除蛋白發(fā)酵液； c、利用活性炭或凹土對所述除蛋白發(fā)酵液吸附脫色，獲得脫色發(fā)酵液； d、使用離子交換樹脂對所述脫色發(fā)酵液進(jìn)行離子交換，去除所述脫色發(fā)酵液中的無機(jī)鹽，獲得除鹽發(fā)酵液； e、將所述除鹽發(fā)酵液進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，然后在所得濃縮液中加入有機(jī)溶劑進(jìn)行降溫結(jié)晶，離心分離獲得晶體； f、洗滌所述晶體，利用真空程序升溫干燥法對洗滌后晶體進(jìn)行干燥，即完成對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸的分離提純，獲得產(chǎn)物N-乙酰神經(jīng)氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a所述蒙脫石粉為鈣基蒙脫石；所述蒙脫石粉的加入量為所述發(fā)酵液質(zhì)量的10?20%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a所述板框過濾器中濾布孔徑大小為1000?5000目。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟a所述的離心是通過管式高速離心機(jī)，以不低于1000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，以使菌體沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟b所述的加熱處理的時間不少于0.5h，以使雜蛋白徹底變性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟c所述的活性炭或凹土的加入量為所述除蛋白發(fā)酵液質(zhì)量的1%?5%，所述的吸附溫度為20?50°C，所述吸附時間不少于0.5h0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟d所述離子交換樹脂為陽離子交換樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述陽離子交換樹脂為DOOl型陽離子交換樹脂。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟e中所述濃縮液的濃度為100?200g/L ;所述有機(jī)溶劑為一元有機(jī)酸或一元醇和一元有機(jī)酸按體積比1:2?1:5構(gòu)成的混合物；所述有機(jī)溶劑的加入量為所述濃縮液體積的2?5倍；所述降溫結(jié)晶的溫度為2?30°C，結(jié)晶時間為10?50h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟f所述洗滌是以無水乙醇作為洗滌液進(jìn)行洗滌；步驟f所述干燥是通過程序升溫干燥法，在70?80°C真空烘干I?6h，再在80?90 °C真空供干I?6h。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行分離提純的方法，其特征在于：以大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)酵液為原料，通過除菌、除蛋白、脫色、除鹽、結(jié)晶等步驟獲得了高純度的N-乙酰神經(jīng)氨酸產(chǎn)品。經(jīng)測試產(chǎn)品純度至少為98％，可以滿足其在食品、保健、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的要求，且本發(fā)明的方法簡單易操作，特別適合于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸。
【IPC分類】C07H13-06, C07H1-06
【公開號】CN104628794
【申請?zhí)枴緾N201510103343
【發(fā)明人】袁麗霞, 陳祥松, 吳金勇, 孫立潔, 王剛, 朱薇薇, 王紀(jì), 姚建銘, 費(fèi)賢春, 王煜
【申請人】武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年3月10日