抗菌肽wy-21及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及抗菌肽WY-21及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素濫用造成耐藥性細菌的產(chǎn)生，也會造成抗生素在畜產(chǎn)品中殘留，帶來食品 安全問題。由于耐藥性問題的嚴重化，越來越多的抗生素對病原菌喪失了殺傷作用。同時 長期使用抗生素會破壞影響腸道的穩(wěn)態(tài)，引起腸道菌群紊亂，從而破壞機體的先天免疫。因 此，尋找安全、高效的抗菌藥物成為了研宄熱點。
[0003] 抗菌肽，又叫抗微生物肽（Antimicrobial Peptides，AMP)，是機體先天免疫的重 要組成成分，是許多生物體抵抗外來致病菌侵襲的第一道屏障?？咕木哂袕V譜抗菌殺菌 活性，且主要通過破壞細菌細胞膜發(fā)揮作用，不容易產(chǎn)生耐藥性。同時抗菌肽還具有多樣的 生物學(xué)功能：刺激細胞增殖，激活免疫系統(tǒng)，抗病毒，抗肥胖，抗炎癥反應(yīng)。由于其獨特作用 機制與廣泛生物學(xué)功能引起了科學(xué)界的關(guān)注，將其作為設(shè)計新型抗菌、抗感染制劑的分子 模板。所以說抗菌肽是研發(fā)新型高效抗生素替代品的重要突破。
[0004] a -螺旋抗菌肽是分布最廣泛的抗菌肽，當形成a螺旋結(jié)構(gòu)時通常親水性殘基和 疏水性殘基分別位于螺旋的兩側(cè)，因此呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)依賴性的兩親結(jié)構(gòu)。螺旋抗菌肽在水相中 一般不具有明顯的結(jié)構(gòu)特征，但在富含脂類的細胞膜環(huán)境下形成典型的a螺旋結(jié)構(gòu)。此類 抗菌肽主要通過破壞細菌細胞膜發(fā)揮殺菌作用，導(dǎo)致膜上電解質(zhì)或其他信號物質(zhì)的逐級降 解等，細菌不易產(chǎn)生耐藥性。然而，天然的抗菌肽部分存在免疫原性、抗菌活性低，穩(wěn)定性 差，細胞毒性強，溶血率高等問題限制了其作為抗菌藥物的推廣應(yīng)用。因此，尋找分子量小、 抗菌活性強、安全性高、穩(wěn)定性好的抗菌肽是實現(xiàn)抗菌肽部分替代抗生素的關(guān)鍵因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種安全高效的抗菌肽WY-21及其應(yīng)用。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種抗菌肽WY-21，其全序列為：纈氨 酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨 酸-纈氨酸-賴氨酸-谷氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨 酸-賴氨酸-精氨酸。為序列表N01所示。
[0007] 作為本發(fā)明的抗菌肽WY-21的改進：所述的抗菌肽WY-21為人工設(shè)計合成的a螺 旋陽離子多肽，包含21個氨基酸殘基，分子量為2624. 2Da，等電點為10. 79,凈電荷為+8。
[0008] 本發(fā)明還同時公開了上述抗菌肽WY-21的用途：制備治療革蘭氏陰性菌或者革蘭 氏陽性菌感染的廣譜抗菌藥物。
[0009] 本發(fā)明還同時公開了上述抗菌肽WY-21的用途：制備發(fā)揮免疫調(diào)控作用從而降低 炎癥的藥物。
[0010] 備注說明：革蘭氏陰性菌包括 E. coli ATCC25922、E. coli K 88、E. coli K 12、 E. coli EPEC 078:K80、E. coli EPEC 0144:K26、E. coli EPEC 044:K74、S. choleraesuis CMCC50020, S.typhimurium CMCC50013, S.enteritidis CMCC5004U P.aeruginosa CMCC27853 ;革蘭氏陽性菌包括 S. aureus ATCC25923、S?印idermidis ATCC12228。
[0011] 本發(fā)明的抗菌肽WY-21的使用方法和用量可參照常規(guī)抗菌肽（特別是對革蘭氏陰 性菌或者革蘭氏陽性菌感染具有廣譜抗菌性能的抗菌肽）的使用方法和用量，例如可參照 多肽PG-1和CP-1等。
[0012] 本發(fā)明所設(shè)計合成的抗菌肽WY-21為a螺旋陽離子多肽，具有肽鏈長度較短、穩(wěn) 定性較好、人工合成方便的特點。將抗菌肽WY-21的氨基酸序列經(jīng)NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫搜尋比 對，未發(fā)現(xiàn)有相同的多肽?？咕腤Y-21具有凈電荷高、抗菌譜廣、殺菌作用強等優(yōu)點，同時 具有溶血活性低和細胞毒性小、能發(fā)揮免疫調(diào)控作用從而降低炎癥等特點。
【附圖說明】
[0013] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0014] 圖1是不同溶度的抗菌肽WY-21對豬紅細胞的溶血率對比圖，以上結(jié)果為6次獨 立重復(fù)實驗平均值。
[0015] 圖2是不同溶度抗菌肽WY-21對豬PMBCs的細胞毒性對比圖，LDH表示乳酸脫氫 酶，以上結(jié)果為6次獨立重復(fù)實驗平均值。
[0016] 圖3是對照組、WY-21組、LPS組、LPS+WY-21組對LPS引起的巨噬細胞炎癥的緩解 作用對比圖。
[0017] 圖4是不同溶度的抗菌肽PG-1對豬紅細胞的溶血率對比圖。
[0018] 圖5是CP-1對LPS引發(fā)的巨噬細胞炎癥的緩解作用圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面的實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于 此。
[0020] 實施例1、抗菌肽WY-21的制備
[0021] 抗菌肽WY-21的制備利用固相化學(xué)合成法，根據(jù)
【發(fā)明內(nèi)容】
中所述的氨基酸序列， 用自動多肽合成儀從C端到N端逐一進行合成。通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。純化的 抗菌肽WY-21用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，純度高于95%。用基質(zhì)輔助激光解析 電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-T0F)測定其分子量，與理論分子量基本一致，用自動氨基酸測 序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0022] 人工合成的抗菌肽WY-21包含21個氨基酸殘基，分子量為2624. 2Da，其全序列為： 纈氨酸_賴氨酸_苯丙氨酸-苯丙氨酸_精氨酸_賴氨酸_亮氨酸_賴氨酸-賴氨酸-絲 氨酸-纈氨酸_賴氨酸_谷氨酸_賴氨酸_異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸_谷氨酸_苯丙氨 酸-賴氨酸-精氨酸。為序列表N01所示。
[0023] 抗菌肽WY-21的理化參數(shù)如表1所示。
[0024] 表1、抗菌肽WY-21的理化參數(shù)
[0025]
【主權(quán)項】
1. 抗菌肽WY-21，其特征在于：其全序列為：纈氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精 氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸-賴氨酸-谷氨酸-賴氨酸-異 亮氨酸_甘氨酸_賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽WY-21，其特征在于：所述抗菌肽WY-21為人工設(shè)計合 成的活性多肽，包含21個氨基酸殘基，分子量為2624. 2Da，等電點為10. 79,凈電荷為+8。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的抗菌肽WY-21的用途，其特征在于：制備治療革蘭氏陰性 菌或者革蘭氏陽性菌感染的廣譜抗菌藥物。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的抗菌肽WY-21的用途，其特征在于：制備發(fā)揮免疫調(diào)控作 用從而降低炎癥的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗菌肽WY-21，其全序列為：纈氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸-賴氨酸-谷氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-精氨酸。該抗菌肽WY-21的用途是：制備治療革蘭氏陰性菌或者革蘭氏陽性菌感染的廣譜抗菌藥物；制備發(fā)揮免疫調(diào)控作用從而降低炎癥的藥物。
【IPC分類】A61K38-16, A61P31-04, C07K14-00
【公開號】CN104628829
【申請?zhí)枴緾N201510065017
【發(fā)明人】汪以真, 易宏波
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月6日