重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的制備工藝及其分離純化工藝、HBsAg和乙肝疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組基因的乙肝疫苗制備工藝技術(shù)，尤其涉及一種重組釀酒酵母表達(dá) 乙肝表面抗原（HBsAg)的制備工藝及其分離純化工藝、HBsAg和乙肝疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是乙型肝炎高流行區(qū)，每年平均報(bào)告發(fā)病人50多萬(wàn)例，而接種乙肝疫苗是預(yù) 防乙型肝炎最有效、最經(jīng)濟(jì)，也是最有保障的方法。我國(guó)于1992年將乙型肝炎疫苗納入計(jì) 劃免疫管理，2009年開(kāi)始，國(guó)家又將乙型肝炎免費(fèi)接種范圍擴(kuò)大至對(duì)15歲以下青少年兒 童，以及醫(yī)務(wù)人員、大學(xué)生和現(xiàn)役軍人等，全國(guó)接種乙肝疫苗的需求愈來(lái)愈大，覆蓋范圍越 來(lái)越廣。2010版新版GMP的實(shí)施，對(duì)藥企的生產(chǎn)及藥品質(zhì)量提出了更高的要求。如今全國(guó) 各乙肝疫苗廠(chǎng)家均在積極通過(guò)生產(chǎn)技術(shù)優(yōu)化、改進(jìn)及革新等措施，力求進(jìn)一步提高生產(chǎn)效 率和提升產(chǎn)品質(zhì)量，以確保接種范圍擴(kuò)大后的市場(chǎng)需求和質(zhì)量保證。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，在表達(dá)HBsAg的重組釀酒酵母細(xì)胞破碎和純化的生產(chǎn)過(guò)程中，為防 止HBsAg被蛋白酶分解，主要采用在破碎前加入苯甲基磺酰氟溶液（苯甲基磺酰氟是一種 蛋白酶抑制劑，對(duì)眼睛、鼻子及喉嚨有刺激作用）的方法。
[0004] 然而，發(fā)明人在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，上述加入蛋白酶抑制劑的方案存在以 下缺陷：
[0005] 由于蛋白酶抑制劑半衰期短（約30分鐘），而在大規(guī)模生產(chǎn)中，細(xì)胞破碎所需要的 時(shí)間較長(zhǎng)（60~80分鐘），往往導(dǎo)致破碎過(guò)程的后期，蛋白酶抑制劑的作用已經(jīng)下降或者消 失，使破碎釋放出的目標(biāo)物HBsAg被蛋白酶一定程度的分解，從而提高了后續(xù)純化難度，導(dǎo) 致純化得到的原液收率及質(zhì)量均受到影響；另外，由于加入的蛋白酶抑制劑進(jìn)入緩沖體系， 還帶來(lái)了二度污染問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工 藝，該工藝可在無(wú)需在細(xì)胞破碎前加入蛋白酶抑制劑的情況下使蛋白酶失去活性，從而避 免蛋白酶抑制劑帶來(lái)的二度污染，且可明顯提高后續(xù)純化得到的原液收率，并大大改善原 液的"比活"、"Sub_p24"等質(zhì)量指標(biāo)，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步所解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的制備工 藝，該工藝可在無(wú)需在細(xì)胞破碎前加入蛋白酶抑制劑的情況下使蛋白酶失去活性，從而避 免蛋白酶抑制劑帶來(lái)的二度污染，且可明顯提高后續(xù)純化得到的原液收率，并大大改善原 液的"比活"、"Sub_p24"等質(zhì)量指標(biāo)，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了以下方案：
[0009] -種重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工藝，包括有：
[0010] 細(xì)胞破碎步驟，將經(jīng)過(guò)發(fā)酵后提取的酵母細(xì)胞供入高壓勻漿器內(nèi)，在 15000±1500PSIG壓力下對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞破碎；
[0011] 純化步驟，對(duì)破碎后的料液進(jìn)行純化，制備HBsAg原液；
[0012] 在所述細(xì)胞破碎步驟后、純化步驟之前還包括：
[0013] 料液加熱步驟，對(duì)破碎后的料液進(jìn)行加熱操作，使其溫度上升到50-80°C后，再將 其降溫到2~8°C。
[0014] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到60-80°C。
[0015] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到60-70°C。
[0016] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到65±1°C。
[0017] 優(yōu)選地，在所述料液加熱步驟中，通過(guò)在套設(shè)于所述勻漿器外部的夾套中傳遞傳 熱介質(zhì)，對(duì)所述勻漿器內(nèi)經(jīng)細(xì)胞破碎后的料液進(jìn)行加熱。
[0018] 優(yōu)選地，所述夾套中傳熱介質(zhì)的傳遞方向與勻漿器內(nèi)料液的流動(dòng)方向相反。
[0019] 優(yōu)選地，在所述細(xì)胞破碎步驟之前包括：
[0020] 冷凍懸液融化步驟，將經(jīng)過(guò)發(fā)酵后提取并冷凍保存的酵母細(xì)胞懸液從冷凍保存裝 置中轉(zhuǎn)移到溫度穩(wěn)定在26 ± 1 °C的水浴鍋內(nèi)，至其融化完成；
[0021] 所述提純步驟包括：
[0022] 澄清抗原制備步驟，除去在所述勻漿器破碎并加熱后的料液中的酵母菌碎片后， 通過(guò)加入硅膠380吸附目標(biāo)抗原，并通過(guò)引入硼酸，將抗原由硅膠上解吸附，收集合并洗脫 液，制備成澄清抗原；
[0023] 原液制備步驟，將所述澄清抗原進(jìn)一步用疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處 理，用磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)^(guò)濾后即為原液。
[0024] 相應(yīng)地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的制備工藝，包括發(fā)酵步 驟和分離純化步驟，所述分離純化步驟采用如上所述的分離純化工藝。
[0025] 相應(yīng)地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg，該乙肝表面抗原采用如 上所述的工藝生產(chǎn)制得。
[0026] 相應(yīng)地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種乙肝疫苗，該乙肝疫苗的活性成分包括有如上所述 的重組釀酒酵母表達(dá)的HBsAg。
[0027] 本發(fā)明的有益效果是：
[0028]本發(fā)明的實(shí)施例通過(guò)在細(xì)胞破碎步驟后，將破碎后的料液進(jìn)行加熱使其溫度快速 上升到50-80°C，使蛋白酶失去活性后，再對(duì)料液進(jìn)行純化，從而不僅實(shí)現(xiàn)了無(wú)需在細(xì)胞破 碎前加入蛋白酶抑制劑，避免了其帶來(lái)的二度污染，并對(duì)目標(biāo)物HBsAg的活性無(wú)任何不利 影響；還明顯提高了其后續(xù)純化得到的HBsAg原液收率，并大大改善了 HBsAg原液的"比 活"、"Sub-p24"等質(zhì)量指標(biāo)，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030] 圖1是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工藝一個(gè)實(shí)施例中破碎后料 液加熱狀態(tài)示意圖。
[0031] 圖2是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工藝第四實(shí)施例與現(xiàn)有技術(shù) 的抗原收率對(duì)比示意圖。
[0032] 圖3是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工藝第四實(shí)施例與現(xiàn)有技術(shù) 的比活值對(duì)比示意圖。
[0033] 圖4是本發(fā)明的重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工藝第四實(shí)施例與現(xiàn)有技術(shù) 的Sub-p24值對(duì)比示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面參考圖1詳細(xì)描述本發(fā)明提供的重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化工藝的 第一實(shí)施例；本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)一次重組釀酒酵母表達(dá)HBsAg的分離純化流程主要包括以下步 驟：
[0035] 在細(xì)胞破碎步驟中，將經(jīng)過(guò)發(fā)酵后提取的酵母細(xì)胞供入高壓勻漿器內(nèi)，在 15000±1500PSIG壓力下對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞破碎；
[0036] 在純化步驟中，對(duì)破碎后的料液進(jìn)行純化，制備HBsAg原液。
[0037] 并且，關(guān)鍵地，在所述細(xì)胞破碎步驟后、純化步驟之前還包括：
[0038] 在料液加熱步驟中，對(duì)破碎后的料液進(jìn)行加熱操作，使其溫度上升到50_80°C后， 再將其降溫到2~8°C。
[0039] 具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，在所述料液加熱步驟中，可通過(guò)在套設(shè)于所述勻漿器外部的夾套中 傳遞傳熱介質(zhì)，對(duì)所述勻漿器內(nèi)經(jīng)細(xì)胞破碎后的料液進(jìn)行加熱。
[0040] 進(jìn)一步地，所述夾套中傳熱介質(zhì)的傳遞方向可設(shè)置為與勻漿器內(nèi)料液的流動(dòng)方向 相反，從而達(dá)到更充分地交換傳遞熱量、加快溫度升高所需時(shí)間的效果。
[0041] 更進(jìn)一步地，可通過(guò)自控裝置PID控制加熱過(guò)程中的各項(xiàng)參數(shù)，如控制傳熱介質(zhì) 流向、設(shè)定加熱溫度等。
[0042] 本實(shí)施例中，所述傳熱介質(zhì)可采用乙二醇，具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，可先通過(guò)工業(yè)蒸汽或電加 熱的方式將乙二醇加熱至所需的溫度后，沿與勻漿器內(nèi)料液流向相反的方向從傳熱介質(zhì)入 口進(jìn)入所述夾套中對(duì)所述料液進(jìn)行熱交換。
[0043] 另外，本實(shí)施例中，在所述細(xì)胞破碎步驟之前還可包括：
[0044] 在冷凍