一種鴨坦布蘇病毒e蛋白線性b細胞抗原表位多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原 表位多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2010年4月以來，我國主要的蛋鴨養(yǎng)殖區(qū)浙江、福建、山東、上海、江蘇等地陸續(xù)暴 發(fā)了一種以蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特 征的急性傳染病，經(jīng)濟損失高達數(shù)十億元。隨著病原學(xué)研宄的深入，該病被確診是由一種新 型黃病毒-鴨坦布蘇病毒0>uck Tembusu virus，DTMUV)引起。該病具有發(fā)病急、傳播速度 快、發(fā)病率高等特點，病鴨主要表現(xiàn)為高熱、食欲下降甚至廢絕、產(chǎn)蛋數(shù)量下降直至停產(chǎn)、群 內(nèi)發(fā)病率高達100%，病死率約為5%~10%。時至今日，DTMUV仍是危害我國水禽養(yǎng)殖業(yè) 的主要疫病。
[0003] DTMUV 屬于黃病毒科（Flaviviridate)黃病毒屬（Flavivirus)，DTMUV 基因組由 5'端和3'端非編碼區(qū)和一個開放閱讀框組成，編碼三個結(jié)構(gòu)蛋白和七個非結(jié)構(gòu)蛋白，三個 結(jié)構(gòu)蛋白分別為核衣殼蛋白（C)、膜蛋白（PrM/M)和囊膜糖蛋白（E)，其中，DTMUV E蛋白是 病毒離子表面最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，由501個氨基酸殘基構(gòu)成，含有1個糖基化位點。根據(jù)黃 病毒科成員的結(jié)構(gòu)特點，推測DTMUV E位于病毒表面，在病毒感染靶細胞的受體結(jié)合、膜融 合和侵入過程中起著關(guān)鍵的作用。DTMUV E蛋白在病毒感染早期即可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生血凝抑 制抗體、補體結(jié)合抗體、中和抗體，從而引起宿主產(chǎn)生保護性的免疫應(yīng)答，同時E蛋白還具 有神經(jīng)侵襲性和神經(jīng)毒性的致病性位點，為病毒進入神經(jīng)細胞的必要蛋白。黃病毒E蛋白 在空間上形成三個不同的結(jié)構(gòu)域，即Dp Dn，Dm。Di包含E1~51、E137~196和E293~ 311位的130個氨基酸殘基、具有糖基化位點和生物活性的抗原表位；D n包含E52~136和 E197~292位的181個氨基酸殘基，具有中和活性和血凝活性的抗原表位；Dni包含E312~ 411位的100個氨基酸殘基，參與受體結(jié)合過程，在黃病毒屬中十分保守，而與此同時，D m 結(jié)構(gòu)域是一個假定的受體結(jié)構(gòu)域，是病毒與細胞受體結(jié)合的區(qū)域，其內(nèi)可能含有與病毒致 病性相關(guān)的抗原決定簇。
[0004] 因此，有必要針對DTMUV E蛋白的Dni結(jié)構(gòu)域研宄，定位E蛋白DIn結(jié)構(gòu)域的抗原 表位，為研宄基于抗原表位的新型疫苗和診斷方法奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽及其應(yīng)用，該抗 原表位多肽為鴨坦布蘇病毒E蛋白B細胞的線性表位，具有良好的免疫原性，可用于制備鴨 坦布蘇病毒的表位疫苗以及診斷或檢測感染了鴨坦布蘇病毒的動物血清的試劑。
[0006] 本發(fā)明提供了一種鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽，氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0007] 該抗原表位多肽為鴨坦布蘇病毒E蛋白B細胞的線性表位，氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示（385LVGSGKGQI393)。該抗原表位序列在鴨、鵝坦布蘇E蛋白中為保守序列。
[0008] 編碼所述鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽的基因，
[0009] 優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 為鑒定鴨坦布蘇病毒（DTMUV)的B細胞抗原表位，本發(fā)明以純化的DTMUV YY5株 為抗原獲得了 2株單克隆抗體AE4和BD10,免疫印跡結(jié)果顯示BD10為線性化表位，其結(jié)合 的抗原表位位于E蛋白的第三結(jié)構(gòu)域（Domain III，Dni)。將DTMUV E蛋白Dni結(jié)構(gòu)域基因 截短為具有末端相互重疊的15段，與MBP融合表達后以單克隆抗體BD10進行肽庫掃描，結(jié) 果篩選出DTMUV的一個B細胞線性表位 385LVGSGKGQI393 (EP385)。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽在制備鴨坦 布蘇病毒的疫苗中應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽在制備診斷 或檢測鴨坦布蘇病毒試劑中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種所述的基因的重組載體、轉(zhuǎn)化子或試劑盒。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0015] 本發(fā)明篩選出DTMUV的一個B細胞線性表位，該表位與MBP融合表達后免疫小鼠， 獲得的多克隆抗體能夠和E蛋白反應(yīng)，表明出良好的免疫原性，為DTMUV多肽疫苗的研制及 特異血清學(xué)診斷方法的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0016] 圖1為單克隆抗體的間接免疫X光反應(yīng)結(jié)果；
[0017] A :單克隆抗體AE4,B :單克隆抗體BD10, C :陽性對照，D :陰性對照。
[0018] 圖2為單克隆抗體的Western blot分析結(jié)果；
[0019] A:單克隆抗體:單克隆抗體AE4;
[0020] M :預(yù)染蛋白質(zhì)marker;1 :MBP;2:MBP-E 重組蛋白。
[0021] 圖3為融合蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果；
[0022] M:標準蛋白分子marker;1:MBP空載體對照；E1-E15 :融合蛋白；94102 :表位短 肽。
[0023] 圖4為鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位的ELISA篩選。
[0024] 圖5為鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位的western blot篩選。
[0025] 圖6為鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位的鑒定結(jié)果示意圖。
[0026] 圖7為融合的鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位的Western blot印證結(jié) 果；
[0027] M:預(yù)染標準蛋白 marker ;1:Din蛋白；2 :MBP-EP385 ;3 :MBP-E 融合蛋白。
【具體實施方式】
[0028] 本發(fā)明實施例中所述的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029] 本發(fā)明采用的材料信息如下：質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；膠回收試劑盒、 pMD18_T載體、限制性內(nèi)切酶、DNAMarker購自寶生物公司；TranslO、Transl_Tl感受態(tài)購自 北京全式金公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；弗氏佐劑、PEG3350、HAT、HT購自SIGMA 公司；辣根過氧化物酶（HRP)標記的羊抗鼠IgG購自北京中杉公司；DTMUVYY5分離株、小鼠 骨髓瘤細胞株（SP2/0)，融合表達載體pMBP-c為本實驗室保存；BAL B/c小鼠購自浙江省醫(yī) 學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。
[0030] 實施例1
[0031] 1、單克隆抗體的制備
[0032] 將DTMUVYY5分離株在DF-1細胞增殖后，采用不連續(xù)蔗糖梯度離心法提純病毒。 將純化的病毒用丙內(nèi)酯進行滅活，按照《抗體技術(shù)實驗指南》（作者：E.哈洛，沈關(guān)心等 譯，科學(xué)出版社，2002年9月第一版）的方法進行BAL B/c小鼠的免疫以及細胞融合，用間 接免疫熒光（IFA) *Dm-ELISA交叉篩選雙陽性雜交瘤細胞株。
[0033] 以純化的DTMUV為抗原，按常規(guī)方法進行小鼠免疫和細胞融合，用間接免疫熒光 (IFA)和Din-ELISA交叉篩選到2株雙陽性單克隆抗體，分別命名為AE4和BD10 (圖1)。免 疫印跡結(jié)果顯示，BD1(I能夠特異性地識別DTMUV E蛋白，而AEjlj不能（圖2)。由此可以確 定BD1Q識別DTMUV E蛋白的線性表位，而AE4識別E蛋白的構(gòu)象表位。
[0034] 2、融合蛋白的表達及純化
[0035] 根據(jù)E蛋白基因序列，遞交生物信息學(xué)網(wǎng)站（http ://www. cbs. dtu. dk/services/ software, php)進行B細胞表位預(yù)測，設(shè)-H^ -套覆蓋E蛋白Dni結(jié)構(gòu)域（AA291-AA406)并 盡可能涵蓋預(yù)測表位的15個短肽，這些短肽長約16個氨基酸，相鄰兩個短肽末端彼此重疊 6-8個氨基酸。針對每條短肽合成正負兩條寡核苷酸鏈，相互配對，序列如表1所示，每對 寡核苷酸鏈退火后在5'端和3'端分別形成BamHI和Nhel粘性末端。將退火的DNA與經(jīng) BamHI，NheI雙酶切的載體pMBP-C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TranslO感受態(tài)，將測序正確的 陽性克隆擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期（0D600 = 0. 6)時加終濃度為100μg/ml的IPTG， 30 °C誘導(dǎo)培養(yǎng)3h。用Amy lose親和層析柱純化融合蛋白，操作步驟按說明書進行，SDS-PAGE 檢測表達純化情況。
[0036] 將編碼15個短肽和表位短肽的寡核苷酸退火后插入表達載體pMBP-c，經(jīng)IPTG誘 導(dǎo)后，各融合蛋白均得到了可溶性的表達。將表達的蛋白經(jīng)MBP柱純化后得到了純化的融 合蛋白（見圖3)。
[0037] 3、抗原表位的鑒定
[0038] 3. 1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)篩選
[0039] 用0. lmol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9. 6)將純化的蛋白稀釋至5 y g/ml，以100 y 1/孔 包被ELISA板，4°C過夜，用5%脫脂乳37°C封閉2h。封閉后用PBST(PBS含0. 05%Tween-20) 洗三次，加入雜交瘤培養(yǎng)上清液，37°C孵育lh，PBST洗3次；加入1 : 5000稀釋的HRP標記 羊抗鼠IgG抗體，37°C孵育lh，PBST洗3遍，加入TMB顯色液避光顯色10分鐘，加入50 y 1/ 孔2mol/L H2S04終止液終止反應(yīng)，450nm波長測量吸收值。
[0040] 表1編碼短肽寡核苷酸序列表
[0041]
【主權(quán)項】
1. 一種鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽的基因。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 如權(quán)利要求1所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽在制備鴨坦布蘇 病毒疫苗中的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求1所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽在制備診斷或檢 測鴨坦布蘇病毒試劑中的應(yīng)用。
6. -種包含權(quán)利要求3所述的基因的重組載體。
7. -種包含權(quán)利要求3所述的基因的轉(zhuǎn)化子。
8. -種包含權(quán)利要求3所述的基因的試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鴨坦布蘇病毒E蛋白線性B細胞抗原表位多肽及其應(yīng)用，該抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明篩選出DTMUV的一個B細胞線性表位，該表位與MBP融合表達后免疫小鼠，獲得的多克隆抗體能夠和E蛋白反應(yīng)，表明出良好的免疫原性，為DTMUV多肽疫苗的研制及特異血清學(xué)診斷方法的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】A61P31-14, C12N15-40, C07K14-18, G01N33-569, A61K39-12, G01N33-68
【公開號】CN104628831
【申請?zhí)枴緾N201510040628
【發(fā)明人】余斌, 張存, 倪征, 華炯鋼, 陳柳, 云濤, 葉偉成
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年3月20日