一種發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶抑制劑及其編碼基因與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶抑制劑及 其編碼基因與應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋是生物資源的寶庫，全球80%以上的物種蘊藏于海洋中。由于長期生存在 高鹽、高壓和缺氧的海洋特殊生態(tài)環(huán)境中，海洋生物的生理結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物與陸地生物不 同，產(chǎn)生并積累了大量具有特殊化學結(jié)構(gòu)、特殊生理活性和功能的物質(zhì)，是開發(fā)新型海洋藥 物的重要資源。海洋生物資源主要包括海洋生物毒素、生理活性物質(zhì)、生物信息物質(zhì)及生 物功能材料等。海洋生物活性物質(zhì)是海洋生物資源的重要組成部分，迄今已在海洋生物中 發(fā)現(xiàn)三千余種新型活性物質(zhì)，其中不少海洋生物活性物質(zhì)已被證實具有抗腫瘤、抗病毒、抗 菌、抗心腦血管疾病、抗疲勞以及增強免疫等功效。海洋生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用成為現(xiàn)代 藥物與保健食品研究的熱點。目前，海洋生物資源的活性研究主要側(cè)重于抗腫瘤與抗菌等 方面，而具有顯著生物活性的海洋生物資源主要包括海洋微生物和海洋無脊椎動物（如海 鞘、海綿、水母、?？⒑Ｍ玫龋?。
[0003] 海洋微生物種類繁多，據(jù)統(tǒng)計有200萬~2億種。海洋無脊椎動物缺乏后天免疫 系統(tǒng)的多樣化抗體，僅能依靠先天免疫系統(tǒng)抵抗入侵細菌或病原體。在漫長的自然選擇壓 力和復雜的海洋環(huán)境作用下，海洋無脊椎動物的先天免疫系統(tǒng)非常有效且很強大。研究發(fā) 現(xiàn)，海洋無脊椎動物的內(nèi)源性抗菌活性物質(zhì)非常豐富，已成為開發(fā)新型抗菌藥物的重要資 源。水母屬刺胞動物門，是一類分布廣泛、生物總量非常龐大的海洋浮游生物。水母體內(nèi)富 含多種生物活性物質(zhì)，包括水母毒素蛋白和一些活性強烈、具有良好開發(fā)前景的新功能蛋 白。已有研究發(fā)現(xiàn)，水母體內(nèi)也含有較多的抗菌肽及凝集素類等，這對于生存在復雜海水表 層環(huán)境中的水母抵御外界細菌、病毒入侵有重要意義。提示從水母體內(nèi)很可能獲得具有抗 病毒、抑菌作用的活性物質(zhì)。
[0004] 絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor)是一類具有共同來源的多肽 類絲氨酸蛋白酶抑制劑的總稱（超過500個家族成員），廣泛分布于真核生物和病毒中，通 過調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的活性，參與纖溶、炎癥反應、細胞遷移、細胞分化以及細胞凋亡等許 多重要的生命活動。此外，在凝血系統(tǒng)和補體系統(tǒng)中發(fā)揮作用的蛋白酶也會受絲氨酸蛋白 酶抑制劑的調(diào)控以避免其蛋白酶活性對周圍組織造成破壞。近年來研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白 酶抑制劑在先天免疫防御過程中也發(fā)揮重要的作用。已知大部分動植物的病原微生物會向 宿主體內(nèi)分泌蛋白酶，破壞宿主的物理防御以進一步加強感染。宿主體內(nèi)的絲氨酸蛋白酶 抑制劑則通過抑制病原微生物分泌的蛋白酶活性，參與宿主的天然免疫防御過程。
[0005] 絲氨酸蛋白酶抑制劑主要包括：a -巨球蛋白，serpin，Kunitz和Kazal等類型。
[0006] 目前圍繞水生動物Kazal型抑制劑開展的一些研究發(fā)現(xiàn)，Kazal型絲氨酸蛋 白酶抑制劑具有明顯的抑菌活性。如在斑節(jié)對奸（Penaeus monodon)的血細胞中發(fā)現(xiàn) 的含5個Kazal結(jié)構(gòu)域的抑制劑SPIPm2對枯草桿菌蛋白酶有顯著抑制活性，推測其可 能在病原細菌的感染過程中發(fā)揮免疫作用（參見文獻：Somprasong N，Rimphanitehay A, Kittassanakajon A. A five-domain Kazal-type Serine proteinase inhibitor from black tiger shrimp Penaeus monodon and its inhibitory activities[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2006, 30(11) :998_1008.);在中國明對蟲下 (Fenneropenaeus chinensis)的肝胰腺中發(fā)現(xiàn)了含9個Kazal結(jié)構(gòu)域的抑制劑FcSPI-1，研 究表明其不僅在病原微生物侵染時發(fā)揮作用，而且也參與自身蛋白酶活力的調(diào)節(jié)（參見文 獻：Wang Z H, Zhao X F, Wang J X. Characterization, kinetics, and possible function of Kazal-type proteinase inhibitors of Chinese white shrimp, Fenneropenaeus chinensis[J].Fish&Shellfish Immunology,2〇〇9,26(6):885- 897.);在水媳中發(fā) 現(xiàn)的具有3個Kazal結(jié)構(gòu)域的抑制劑Kazal2具有很強的殺滅金黃色葡萄球菌的能 力（參見文獻：Augustin R, Siebert S, Boscht C. Identification of a Kazal-type serine protease inhibitor with potent anti-staphylococcal activity as part of Hydra' s innate immune system[J] ? Developmental and Comparative Immunology, 2009, 33(7) :830_837.);在中國明對奸（Fenneropenaeus chinensis)中發(fā)現(xiàn) 的rFc-Kazal對鰻弧菌、金黃色葡萄球菌、殺鮭氣單胞菌、蘇云金芽孢桿菌均有一定的抑菌 作用（參見文獻：黃明，劉逸塵，張亦陳，等.中國明對蝦Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因 (Fc-Kazal)的重組表達及活性分析[J]?水產(chǎn)學報，2011，35(9):1310-1318.)。
[0007]目前，國內(nèi)外尚未見水母Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑的有關(guān)研究報道。
[0008] 本發(fā)明人所在的課題組一直致力于水母體內(nèi)活性組分的提取和研究，已獲得中 國發(fā)明專利：專利號ZL201310189933. 5,發(fā)明名稱為"一種發(fā)形霞水母硫氧還蛋白及其編 碼基因與應用"，授權(quán)公告號CN103232979B;專利號ZL201310188702. 2,發(fā)明名稱為"一 種發(fā)形霞水母過氧化物還原酶及其編碼基因與應用"，授權(quán)公告號CN103255113B;已申 請中國專利：申請?zhí)?01310258184. 7,發(fā)明名稱為"一種發(fā)形霞水母蝦紅素樣金屬蛋白 酶CALP1及其編碼基因與表達方法"，申請公布號CN 104195124A;申請?zhí)?01310629343. X，發(fā)明名稱為"一種水母心血管毒素粗提物的制備方法"，申請公布號：CN103613653A;申 請?zhí)?01310628068. X，發(fā)明名稱為"一種水母溶血毒素粗提物的制備方法"，申請公布號 CN103626861A等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶抑制劑及其編碼基因，本發(fā) 明的另一目的在于提供該發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，本發(fā)明第三目的在 于提供該發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶抑制劑在制備抗菌藥物、消炎藥物、皮膚防護劑等中的 應用。
[0010] 本發(fā)明通過構(gòu)建發(fā)形霞水母觸手組織CDNA文庫，并對該文庫重組克隆的序列進 行測定和注釋分析，獲得了發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶抑制劑的編碼基因。該發(fā)形霞水母絲 氨酸蛋白酶抑制劑是首次發(fā)現(xiàn)的具有明顯抗菌活性的水母類絲氨酸蛋白酶抑制劑，是水母 體內(nèi)先天免疫系統(tǒng)的重要活性組分，該蛋白在抗菌、消炎藥物研究中具有良好的應用前景。
[0011] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是，通過構(gòu)建發(fā)形霞水母觸手組織CDNA文庫，對其進行測 序和篩選，獲得發(fā)形霞水母絲氨酸蛋白酶抑制劑的編碼基因并進行重組表達，然后對其抑 制絲氨酸蛋白酶類活性和抗菌活性進行研究。
[00