單克隆抗體mers-4及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種單克隆抗體MERS-4及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 新型冠狀病毒（MERS-CoV)于2012年首次在中東地區(qū)被發(fā)現(xiàn)感染人類，隨后這種 病毒感染引起的疾病又先后出現(xiàn)在歐洲幾個(gè)國家和地區(qū)。超過半數(shù)的感染病人均會(huì)出現(xiàn)嚴(yán) 重的呼吸道疾病，其臨床癥狀同2003年爆發(fā)的由SARS-CoV的臨床癥狀非常相似。由于這 種疾病可以人傳染給人，引起了全世界的高度關(guān)注。到目前為止，還沒有特異性的藥物和疫 苗對(duì)這種疾病進(jìn)行治療和預(yù)防。
[0003] MERS-CoV利用其表面的膜蛋白（S蛋白）進(jìn)入易感細(xì)胞。S蛋白由位于N端的S1 結(jié)構(gòu)域和位于近膜端的S2結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域組成，其中病毒對(duì)細(xì)胞易感性是由S1結(jié)構(gòu) 域決定的。通過利用MERS-CoV的S1結(jié)構(gòu)域進(jìn)行共純化實(shí)驗(yàn)，2013年初Raj的研究小組確 定了 dip印tideyl p印tidase4(DPP4,也稱為 CD26)為 MERS-CoV 的受體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種單克隆抗體MERS-4及其編碼基因和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供了一種抗體，命名為單克隆抗體MERS-4,由A鏈和B鏈組成；所述A鏈 為如下（a)或（b): (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b)將序列1 的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的 由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述B鏈為如下（c)或（d) :(c)由序列表中序列3所示的氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)；（d)將序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白質(zhì)。
[0006] 所述A鏈和所述B鏈通過二硫鍵形成單克隆抗體MERS-4。
[0007] 本發(fā)明還保護(hù)一種DNA組合物，由編碼所述A鏈的DNA分子甲和編碼所述B鏈的 DNA分子乙組成。
[0008] 所述DNA分子甲可為如下（1)或（2)或（3)的DNA分子：（1)序列表中序列2自5' 末端第889-2274位核苷酸所示的DNA分子；（2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交 且編碼所述A鏈的DNA分子；（3)與（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述 A鏈的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS和1XSSC、0. 1%SDS各洗膜一次。
[0009] 所述DNA分子乙為如下（4)或（5)或（6)的DNA分子：（4)序列表中序列4自5' 末端第889-1596位核苷酸所示的DNA分子；（5)在嚴(yán)格條件下與（4)限定的DNA序列雜交 且編碼所述B鏈的DNA分子；（6)與（4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述 B鏈的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0010] 本發(fā)明還保護(hù)一種表達(dá)盒組合物，由表達(dá)所述DNA分子甲的表達(dá)盒甲和表達(dá)所述 DNA分子乙的表達(dá)盒乙組成。所述表達(dá)盒甲具體可如序列表的序列2所示。所示表達(dá)盒乙 具體可如序列表的序列4所示。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)一種質(zhì)粒組合物，由重組質(zhì)粒甲和重組質(zhì)粒乙組成；所述重組質(zhì)粒 甲為含有所述DNA分子甲或所述表達(dá)盒甲的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒乙為含有所述DNA分 子乙或所述表達(dá)盒乙的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒甲具體可為含有所述表達(dá)盒甲的PMD18-T 載體。所述重組質(zhì)粒乙具體可為含有所述表達(dá)盒乙的PMD18-T載體。
[0012] 本發(fā)明還保護(hù)將所述重組質(zhì)粒甲和所述重組質(zhì)粒乙共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞得到的 重組細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為293T細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)培養(yǎng)所述重組細(xì)胞得到的抗體（IgGl抗體)。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)一種藥物，其活性成分為所述單克隆抗體MERS-4;所述藥物的功能 為如下（I )、（ II )、（III)或（IV): (I )治療和 / 或預(yù)防MERS-CoV感染；（II )抑制MERS-CoV 增殖；CHI)抑制MERS-CoV入侵哺乳動(dòng)物；（IV)治療和/或預(yù)防MERS-CoV引起的疾病。所 述"抑制MERS-CoV增殖"具體可為抑制MERS-CoV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的增殖。所述哺乳動(dòng) 物細(xì)胞具體可為Huh7細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明還保護(hù)所述單克隆抗體MERS-4在制備藥物中的應(yīng)用；所述藥物的功能為 如下（I )、（ II )、（III)或（IV) : ( I )治療和 / 或預(yù)防 MERS-CoV 感染；（II)抑制 MERS-CoV 增 殖；（III)抑制MERS-CoV入侵哺乳動(dòng)物；（IV)治療和/或預(yù)防MERS-CoV引起的疾病。所述 "抑制MERS-CoV增殖"具體可為抑制MERS-CoV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的增殖。所述哺乳動(dòng)物細(xì) 胞具體可為Huh7細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明提供的單克隆抗體能夠有效抑制MERS-CoV入侵易感細(xì)胞，可作為 MERS-CoV的預(yù)防藥物或治療藥物，對(duì)于MERS-CoV的預(yù)防和治療具有重要的理論指導(dǎo)價(jià)值 和廣泛的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為MERS-4溶液的SDS-PAGE電泳圖。
[0018] 圖2為實(shí)施例2的步驟一至步驟四的中和活性結(jié)果；縱坐標(biāo)為中和活性（％)，橫坐 標(biāo)為稀釋液中的蛋白濃度以e為底的對(duì)數(shù)值。
[0019] 圖3為實(shí)施例2的步驟五的中和活性結(jié)果；縱坐標(biāo)為中和活性（％)，橫坐標(biāo)為稀釋 液中的蛋白濃度以e為底的對(duì)數(shù)值。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0021] 293T細(xì)胞（人腎上皮細(xì)胞系）：ATCC，ATC0? CRL-11268?。Huh7細(xì)胞(肝癌細(xì)胞 系）:JCRB，JCR B04〇3。TZM-BL 細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞系）：NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Cat. No. 8129)。pMD18_T 載體：Takara。pcDNA3.1(+)載體：Invitrogen 公司。骨架質(zhì)粒 pNL4-3R-E_luciferase:參考文獻(xiàn)：He J，Choe S，Walker R，Di Marzio P，Morgan DO, Landau NR. J Virol69:6705 - 6711，1995.。
[0022] 實(shí)施例1、單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)
[0023] 通過序列和模型分析發(fā)現(xiàn)MERS-CoV可能有一個(gè)潛在的受體結(jié)合域（Receptor Binding Domain, RBD)，將RBD和可溶性DPP4蛋白共結(jié)晶，解析蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RBD中有 與DPP4結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。利用純化的RBD進(jìn)行動(dòng)物免疫，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)中 和抗體產(chǎn)生的能力。利用RBD篩選展示在酵母表面的人類非免疫scFvs文庫（scFvs的英文 全稱為"single-chain variable fragments"),得到了若干具有中和活性的單克隆抗體。 將其中一個(gè)單克隆抗體命名為單克隆抗體MERS-4 (屬于IgGl抗體)。
[0024] 實(shí)施例2、單克隆抗體MERS-4的制備
[0025] 1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA片段甲，然后將DNA片段甲插入pMD18-T 載體，得到重組質(zhì)粒甲。
[0026] 序列表的序列2中，自5'末端第1-888位核苷酸為CMV啟動(dòng)子，第889-2274位核 苷酸為單克隆抗體MERS-4的重鏈的編碼基因，第2275-2402為ployA。序列表的序列2所 不的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列1所不的蛋白質(zhì)。
[0027] 2、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA片段乙，然后將DNA片段乙插入pMD18-T 載體，得到重組質(zhì)粒乙。
[0028] 序列表的序列4中，自5'末端第1-888位核苷酸為CMV啟動(dòng)子，第889-1596位核 苷酸為單克隆抗體MERS-4的輕鏈的編碼基因，第1597-1724為ployA。序列表的序列4所 不的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列3所不的蛋白質(zhì)。
[0029] 3、將重組質(zhì)粒甲和重組質(zhì)粒乙共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(轉(zhuǎn)染劑量：每IX105個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染 2微克重組質(zhì)粒甲和2微克重組質(zhì)粒乙，采用的培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基)，37°C靜 置孵育8小時(shí)，然后將培養(yǎng)基更換為含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基并37°C靜置孵育72小時(shí)(實(shí)際 應(yīng)用中，48-72小時(shí)均可)，然后收細(xì)胞培養(yǎng)上清，4°C、4000rpm離心1小時(shí)，收集上清液。
[0030] 4、取步驟 3 得到的上清液，加入 protein A beads (Pierce?Protein A Agarose; Thermo公司），4°C振蕩孵育12小時(shí)，離心取上清液，即為含有單克隆抗體MERS-4的溶液(簡 稱MERS-4溶液)，4°C保存。
[0031] MERS-4溶液的SDS-PAGE電泳圖見圖1。由圖1可以觀察到，MERS-4溶液中并無 其它雜蛋白。分別回收兩個(gè)條帶并測序，一個(gè)條帶的前10位氨基酸殘基為序列表的序列1 的前10位，另一個(gè)條帶的前10位氨基酸殘基為序列表的序列3的前10位。
[0032] 實(shí)施例3、單克隆抗體MERS-4的應(yīng)用
[0033] 一、檢測單克隆抗體MERS-4對(duì)MERS-CoV假病毒的中和活性
[0034] 表達(dá)MERS-CoV全長膜蛋白的質(zhì)粒(命名為MERS-CoV膜蛋白質(zhì)粒）和骨架質(zhì)粒 pNL4-3R-E-lu CiferaSe共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，孵育后能夠得到具有感染性但沒有復(fù)制能力的 MERS-CoV假型病毒，其感染性同活病毒相似。
[0035] 將序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子（MERS-CoV全長膜蛋白的編碼基因）插入 pcDNA3. 1 (+)載體的Hindlll和Xhol酶切位點(diǎn)之間，得到MERS-CoV膜蛋白質(zhì)粒。
[0036] 1、MERS-CoV假病毒的制備
[0037] 將MERS-CoV膜蛋白質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒pNL4-3R-E_luciferase共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞， 37°C靜置孵育，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即為含有MERS-CoV假病毒的病毒液(簡 稱MERS-CoV病毒液)。利用p24定量檢測的ELISA試劑盒（HIV P24抗原定量檢測試劑盒， KEY-BIO, 96T)檢測MERS-CoV病毒液的病毒滴度，MERS-CoV病毒液的0D45Qnm (吸光值為1 (1021TCID50/ml)，吸光值越大說明病毒含量越高。
[0038] 2、檢測單克隆抗體MERS-4對(duì)MERS-CoV假病毒的中和活性
[0039] (1)采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基將實(shí)施例2制備得到的MERS-4溶液倍比稀釋， 依次得到蛋白濃度為 50. 000000 ii g/ml、16. 666670ii g/ml、5. 555555ii g/ml、l. 851852ii g/ mUO. 6172839 u g/mUO. 2057613 u g/mU0.0 6858711 u g/mU0.0