一種抗狂犬病毒的基因工程抗體、其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗狂犬病毒的基因工程抗體、其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是由動(dòng)物傳播的100%致死性傳染病，該病流行于100多個(gè)國家和地區(qū)，在 全球范圍內(nèi)，每年有高達(dá)55000人因狂犬病死亡，而我國的狂犬病病例在2000份左右。當(dāng) 被攜帶有狂犬病毒的動(dòng)物嚴(yán)重咬傷或抓傷時(shí)，即狂犬病毒III級暴露時(shí)，世界衛(wèi)生組織建 議用暴露后預(yù)防（PEP)的方法防治狂犬病。暴露后預(yù)防的方法包括傷口清洗，疫苗注射和 傷口處抗體浸潤注射。
[0003] 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，注射抗狂犬病毒的抗體逐漸成為中和狂犬病毒的重要 方法?，F(xiàn)在在市面上用于侵潤注射的抗體為抗狂犬病毒馬血清（Equine rabies immune globulin，ERIG)和抗狂犬病毒人血清（Human rabies immune globulin，HRIG)，二者均能 有效的中和狂犬病毒。據(jù)報(bào)道，用抗狂犬病毒人血清（HRIG)治療，病人要承擔(dān)約1000美元 的費(fèi)用，價(jià)格過于昂貴，在狂犬病流行的亞非拉地區(qū)，人們承擔(dān)不起，并且抗狂犬病人血清 的來源十分有限，大大限制了其應(yīng)用。相比HRIG，抗狂犬病毒馬血清（ERIG)的價(jià)格雖有降 低，但是其供應(yīng)量仍不足，并且由馬血清導(dǎo)致的過敏反應(yīng)和血液污染，也限制了其進(jìn)一步應(yīng) 用。
[0004] 理論上，單克隆抗體（mAb)更適合工業(yè)化生產(chǎn)，有望能克服狂犬病免疫血清的不 足。但是針對狂犬病毒的單克隆抗體或者說具有中和狂犬病毒活性的單克隆抗體的研究報(bào) 道相對較少。這是因?yàn)樵谘芯窟^程中發(fā)現(xiàn)，一方面狂犬病毒糖蛋白很難在體外表達(dá)純化，即 抗原難以獲得；另一方面表達(dá)狂犬病毒的真核細(xì)胞系常常不能穩(wěn)定傳代，且該技術(shù)成本過 于昂貴，不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
[0005] 基因工程抗體又稱重組抗體，是指利用重組DNA及蛋白工程技術(shù)對編碼抗體的基 因按照不同需要進(jìn)行加工改造和重新裝置，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞所表達(dá)的抗體分子，是 對抗體獲得的重要革新。據(jù)報(bào)道，一系列的抗狂犬病毒基因工程抗體正在研制當(dāng)中，如植 物表達(dá)的單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb), Duan等人研發(fā)的單鏈抗體（single domain fragment variable, scFv)等。但目前還沒有基因工程抗體上市，所以仍然需要對 重組工程抗體進(jìn)行研究，以獲得中和活性高的抗狂犬病毒的重組工程抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種抗狂犬病毒的基因工程抗體、其制備 方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的抗狂犬病毒的基因工程抗體能夠更有效地中和狂犬病毒的能 力，能夠應(yīng)用于制備防治狂犬病毒的藥物，也可以應(yīng)用于制備檢測狂犬病毒的試劑。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種抗狂犬病毒的基因工程抗體，其由重組抗狂犬病毒抗體的重鏈 可變區(qū)、重組抗狂犬病毒抗體的輕鏈可變區(qū)組裝而成；
[0009] 該重組抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)融合有亮氨酸拉鏈；
[0010] 該重組抗狂犬病毒抗體的輕鏈可變區(qū)融合有亮氨酸拉鏈。
[0011] 本發(fā)明的發(fā)明人致力于研究抗狂犬病毒的基因工程抗體，報(bào)道了多個(gè)具有中和活 性的抗狂犬病毒的基因工程抗體，例如，公開號為CN102643343A的專利申請文件中所述的 單鏈抗體Fv57。單鏈抗體（scFv)僅由重鏈可變區(qū)（VH)，輕鏈可變區(qū)（')和連接肽組成，因 此scFv不僅保留了抗體的可變區(qū)（Fv)即狂犬病毒G蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，而且分子量僅為其 母體的IgG抗體的1/6,因此可以用原核系統(tǒng)表達(dá)，從而大大降低了成本。在研究過程中，發(fā) 明人發(fā)現(xiàn)單鏈抗體Fv57仍無法克服單鏈抗體的先天性缺陷，即穩(wěn)定性過低，從而導(dǎo)致其無 法像其母體免疫球蛋白G(IgG)抗體那樣100%保護(hù)被狂犬病毒感染的小鼠。為克服scFv 穩(wěn)定性低這一弱點(diǎn)，在公開號為CN102643343A的專利申請文件中還公開了二硫鍵穩(wěn)定單 鏈抗體ds-scFv，即dsFv57,通過將框架區(qū)（FR)內(nèi)特定位置的氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，?單鏈抗體的重鏈可變區(qū)（V H)和輕鏈可變區(qū)（')之間添加額外的二硫鍵，從而大大增加了 dsFv57的穩(wěn)定性，相對單鏈抗體動(dòng)物保護(hù)力得以提高，但是dsFv57的動(dòng)物保護(hù)力仍無法達(dá) 到100%，這是因?yàn)?，重鏈可變區(qū)（V H)和輕鏈可變區(qū)（')的組裝方式在ds-scFv和單鏈抗 體scFv中一致，而和其母體IgG中是不同的。在IgG抗體中重鏈可變區(qū)（V H)和輕鏈可變 區(qū)（')的作用是非共價(jià)的，VjPV^l過自身的疏水作用形成Fv，并由輕鏈恒定區(qū)（CJ和 重鏈恒定區(qū)I (CHI )之間定疏水作用和二硫鍵得以穩(wěn)定；而在單鏈抗體Fv57和單鏈抗體 dsFv57中，重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（')的作用是共價(jià)的，通過連接肽將重鏈可變區(qū) %的氨基端和輕鏈可變區(qū)的羧基端共價(jià)連接而成或的氨基端和V H的羧基端共價(jià)連接 而成，這種共價(jià)的連接方式在一定程度上阻礙了重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（')組裝 成正確構(gòu)象的Fv，因而無法像母體IgG抗體一樣動(dòng)物保護(hù)力達(dá)到100%。另一方面，在母體 IgG抗體中重鏈可變區(qū)（V H)和輕鏈可變區(qū)（')并不存在二硫鍵，因此突變而來的半胱氨酸 改變了可變區(qū)的氨基酸序列，鑒于蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了它的性質(zhì)，因此這也是單鏈抗 體dsFv57的動(dòng)物保護(hù)力仍無法達(dá)到100%原因之一。
[0012] 經(jīng)過發(fā)明人大量的創(chuàng)造性勞動(dòng)，發(fā)現(xiàn)抗狂犬病毒的單鏈抗體在重鏈可變區(qū)（v H)和 輕鏈可變區(qū)共價(jià)連接之后，在一定程度上阻止了 Fv正確構(gòu)象的形成，因此，模擬重鏈 可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VJ在IgG抗體中的非共價(jià)結(jié)合方式是解決現(xiàn)有的抗狂犬病毒 的單鏈抗體中和活性低的方法之一。在本發(fā)明中，發(fā)明人試圖創(chuàng)新性將亮氨酸拉鏈應(yīng)用于 抗狂犬病毒的基因工程的構(gòu)建，具體為單鏈抗體的重鏈可變區(qū)（V H)和輕鏈可變區(qū)（')的 二聚化。具體地說，以單鏈抗體Fv57為例，用連接肽將亮氨酸拉鏈F0S連接到重鏈可變區(qū) (V H)后形成57VH-F0S，將亮氨酸拉鏈JUN連接到輕鏈可變區(qū)（')后形成57'-JUN，通過亮 氨酸拉鏈F0S和亮氨酸拉鏈JUN的高效且特異性結(jié)合的性質(zhì)，那么重鏈可變區(qū)（V H)和輕鏈 可變區(qū)也將高效的、特異性的、非共價(jià)的二聚化形成Fv，這種二聚化的Fv與IgG里在 C H1和Q的幫助下重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（')非共價(jià)作用形成Fv是一樣的，因此 會(huì)有更高的中和活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，相比原單鏈抗體，本發(fā)明提供的抗狂犬病毒的基因工 程抗體產(chǎn)生了更高的中和活性，差異顯著（P < 0. 05)。
[0013] 在本發(fā)明中，亮氨酸拉鏈為出現(xiàn)在DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)中的一種結(jié)構(gòu)基 元（motif)，當(dāng)來自同一個(gè)或不同多肽鏈的兩個(gè)兩用性的a -螺旋的疏水面（常常含有亮氨 酸殘基）相互作用形成一個(gè)圈對圈的二聚體結(jié)構(gòu)時(shí)就形成了亮氨酸拉鏈。
[0014] 在本發(fā)明中，本發(fā)明提供的基因工程抗體中，重組抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū) 中，亮氨酸拉鏈可以連接在抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)的碳端或氮端。在本發(fā)明中，本發(fā) 明提供的基因工程抗體中，重組抗狂犬病毒抗體的輕鏈可變區(qū)中，亮氨酸拉鏈可以連接在 抗狂犬病毒病毒的輕鏈可變區(qū)的碳端或氮端。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況選擇亮氨 酸拉鏈連接在重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的碳端或氮端。
[0015] 優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的基因工程抗體中，融合在重組抗狂犬病毒抗體的重鏈可 變區(qū)的亮氨酸拉鏈為JUN亮氨酸拉鏈或F0S亮氨酸拉鏈。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，該亮 氨酸拉鏈具體為F0S亮氨酸拉鏈。
[0016] 在本發(fā)明中F0S亮氨酸拉鏈具有如SEQIDN0:7所示的氨基酸序列JUN亮氨酸 拉鏈具有如SEQIDN0:8所示的氨基酸序列。
[0017] 優(yōu)選地，在本發(fā)明提供的基因工程抗體中，融合在重組抗狂犬病毒抗體的輕鏈可 變區(qū)的亮氨酸拉鏈為JUN亮氨酸拉鏈或F0S亮氨酸拉鏈。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，該亮 氨酸拉鏈具體為JUN亮氨酸拉鏈。
[0018] 在本發(fā)明中，融合在重組抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)的亮氨酸拉鏈和融合在重 組抗狂犬病毒抗體的輕鏈可變區(qū)的亮氨酸拉鏈可以相同也可以不同。但是因?yàn)镕0S亮氨酸 拉鏈和JUN亮氨酸拉鏈的相互作用要比F0S亮氨酸拉鏈和F0S亮氨酸拉鏈，JUN亮氨酸拉 鏈和JUN亮氨酸的相互作用至少高1000倍，因此優(yōu)選地，融合在重組抗狂犬病毒抗體的重 鏈可變區(qū)的亮氨酸拉鏈和融合在重組抗狂犬病病毒的鏈可變區(qū)的亮氨酸拉鏈不相同。
[0019] 在本發(fā)明中，亮氨酸拉鏈的選擇、以及組合形式不受本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的亮氨酸拉鏈、及其組合，這也屬于本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的基因工程抗體中，重組抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)中，抗 狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)具有如I、II或III所示的氨基酸序列：
[0021] I具有如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列；
[0022] II具有如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列具有75%同源性的序列；
[0023] III具有如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸 獲得的氨基酸序列。
[0024] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的基因工程抗體中，重組抗狂犬病毒抗體 的重鏈可變區(qū)中，抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)具有如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的基因工程抗體中，重組抗狂犬病毒抗體的輕鏈可變區(qū)中，抗 狂犬病毒抗體的輕鏈可變區(qū)具有如i、ii或iii所示的氨基酸序列：
[0026] i具有如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列；
[0027] ii具有如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列具有75%同源性的序列；
[0028] iii具有如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸 獲得的氨基酸序列。
[0029] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的基因工程抗體中，重組抗狂犬病毒抗體 的輕鏈可變區(qū)中，抗狂犬病毒抗體的輕鏈可變區(qū)具有如SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
[0030] 本發(fā)明提供的基因工程抗體中，重組抗狂犬病毒抗體的重鏈可變區(qū)中，抗狂犬病 毒抗體的重鏈可變區(qū)與亮氨酸拉鏈可以直接相連，也可通過連接肽相連。<