抗前胃泌素的單克隆抗體及其用圖
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年10月15日、發(fā)明名稱為"抗前胃泌素的單克隆抗體及 其用途"的中國(guó)專利申請(qǐng)201080057237. 3 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2010/006329)的分案申請(qǐng)。
[0002] 1.相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0003] 本申請(qǐng)?jiān)?5U. S. C. § 119 (e)下要求2009年10月16日提交的臨時(shí)申請(qǐng) 61/252, 625號(hào)的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)的所有內(nèi)容在此以其整體引入作為參考。
[0004] 2.關(guān)于聯(lián)邦資助研宄的聲明
[0005] 無
[0006] 3.聯(lián)合研宄協(xié)議的參與方
[0007]無
[0008] 4.序列表、表格或計(jì)算機(jī)程序的引用
[0009] 本文包含序列表。 5.
技術(shù)領(lǐng)域
[0010] 本公開涉及抗前胃泌素的單克隆抗體、用于產(chǎn)生這類抗體的組合物和方法，以及 在例如結(jié)腸直腸癌的診斷和/或治療中使用這類抗體的方法等。 6.
【背景技術(shù)】
[0011]結(jié)腸直腸癌（CRC)是主要的公共健康問題，其每年影響超過1，000, 000人，且每 年造成超過500, 000例死亡。CRC是癌癥引起的死亡中的第二位原因。僅在美國(guó)，2009年 報(bào)道了約147, 000例新病例和超過49, 900例CRC引起的死亡。存在三種形式的CRC :散 發(fā)性CRC ;由DNA錯(cuò)配修復(fù)基因中的種系突變引起的遺傳性非息肉性結(jié)腸癌（HNPCC);及由 APC基因中的種系突變引起的家族性腺瘤性息肉?。‵AP)。散發(fā)性CRC占病例的近85%，而 HNPCC 占約 5%，F(xiàn)AP 占約 1% (Heyer 等，1999, Oncogenel8 :5325-5333) 〇
[0012] CRC的臨床治療通常涉及常伴隨化學(xué)療法的腫瘤手術(shù)切除。目前，約50%的CRC 患者在診斷五年內(nèi)死亡。可靠的篩選測(cè)試的缺乏和目前可得的療法的無效性是高死亡率的 主要原因。存在對(duì)用于診斷CRC的新的臨床方法，以及對(duì)其他健康組織具有最小副作用的 對(duì)結(jié)腸直腸癌腫瘤有效的治療的迫切需要。
[0013] 7.發(fā)明概述
[0014] 本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜谠诎ㄈ祟惖膭?dòng)物中診斷和/或治療結(jié)腸直腸癌（CRC)的組合物 和方法。本申請(qǐng)中所述的多種發(fā)明部分基于申請(qǐng)人的單克隆抗體發(fā)現(xiàn)，該單克隆抗體特異 性結(jié)合前胃泌素（PG)，例如人前胃泌素（hPG)(由CRC腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多肽），并在CRC的 體外模型中顯示抗增殖特性。
[0015] 前胃泌素由結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，認(rèn)為它通過觸發(fā)阻斷細(xì)胞正常分化過程（包 括導(dǎo)致細(xì)胞死亡的那些過程）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來刺激這些細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)和體外CRC 模型中，編碼前胃泌素的胃泌素基因轉(zhuǎn)錄物的排除（depletion)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分化 和程序性細(xì)胞死亡，減少腫瘤細(xì)增殖。雖然并非旨在受限于任何操作理論，但認(rèn)為抗-hPG 抗體通過結(jié)合PG來阻斷或抑制其與它的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)發(fā)放配偶體相互作用的能力。這 轉(zhuǎn)而抑制結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞中否則將導(dǎo)致增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
[0016] 因此，一方面，本公開提供特異性結(jié)合PG (例如hPG)但不結(jié)合胃泌素基因的其他 產(chǎn)物的單克隆抗體。參照?qǐng)D1，胃泌素基因翻譯為101個(gè)氨基酸的多肽（稱為前胃泌素原 (pre-progastrin))，其包含信號(hào)序列（下劃線），切割該信號(hào)序列產(chǎn)生前胃泌素（80個(gè)氨基 酸的多肽）。轉(zhuǎn)而切割前胃泌素來產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于前胃泌素的殘基38至71的34個(gè)氨基酸的產(chǎn) 物，然后用甘氨酸殘基在其羧基端延長(zhǎng)，產(chǎn)生甘氨酸延長(zhǎng)的G34( "G34-Gly")。此切割的副 產(chǎn)物是5個(gè)氨基酸的肽（稱為C端側(cè)翼肽或CTFP)，其包含前胃泌素的殘基75至80。然后 進(jìn)一步切割G34-Gly產(chǎn)生17個(gè)殘基的多肽，該多肽在序列上對(duì)應(yīng)于前胃泌素的殘基55至 71，稱為G17-Gly。去除G34-Gly和G17-Gly的C端甘氨酸，然后C端酰胺化，分別產(chǎn)生G34 和G17,二者都是C端酰胺化的。因此，前胃泌素的前37個(gè)殘基是它特有的（即不存在于它 的加工產(chǎn)物，如G34、G34-Gly、G17、G17-Gly或CFTP中），而殘基38至80還存在于胃泌素 基因的翻譯后產(chǎn)物中。
[0017] 申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，雖然可以用技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生抗-PG單克隆抗體，但抗原 的選擇很重要。并非所有衍生自hPG的抗原都在生理?xiàng)l件下刺激特異性結(jié)合hPG的單克 隆抗體的產(chǎn)生。如下文所述，用來產(chǎn)生抗hPG的多克隆抗體的多種抗原（如全長(zhǎng)重組人前 胃泌素（見例如Singh W008/076454)和對(duì)應(yīng)于hPG的C端最后十個(gè)氨基酸的肽（見例如 Hollande W0 07/135542))未能產(chǎn)生抗-hPG單克隆抗體。但是，申請(qǐng)人在hPG序列內(nèi)發(fā)現(xiàn) 了可以用來產(chǎn)生特異性結(jié)合hPG的單克隆抗體的抗原性N端和C端序列。非常令人驚奇， 申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，不必將抗原序列限制于PG序列特有的一段序列來獲得特異性結(jié)合PG而不結(jié) 合其他胃泌素基因衍生產(chǎn)物的單克隆抗體。與胃泌素基因的其他產(chǎn)物（例如G17、G34和 CTFP)具有共同序列的肽抗原產(chǎn)生了不但結(jié)合hPG，而且特異性結(jié)合hPG的單克隆抗體。
[0018] 申請(qǐng)人用衍生自hPG分子不同區(qū)域的抗原產(chǎn)生了單克隆抗體?？捎镁哂袑?duì)應(yīng)于 hPG N端區(qū)域的序列的肽抗原獲得和/或與hPG N端區(qū)域結(jié)合的單克隆抗-PG抗體在本文 中稱為"N端抗-hPG單克隆抗體"?？梢杂脕順?gòu)建用于獲得N端抗-PG單克隆抗體的免疫 原的具體示例性抗原區(qū)對(duì)應(yīng)于hPG的殘基1至14 :SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO :25)。用于 獲得N端抗-PG單克隆抗體的包含此抗原的示例性免疫原描述于表1A和實(shí)施例部分中。
[0019] 可用具有對(duì)應(yīng)于hPG C端區(qū)域的序列的肽抗原獲得和/或結(jié)合hPG C端區(qū)域的單 克隆抗-PG抗體在本文中稱為" C端抗-hPG單克隆抗體"?？梢杂脕順?gòu)建用于獲得C端抗-PG 單克隆抗體的免疫原的具體示例性抗原區(qū)對(duì)應(yīng)于hPG的殘基55至80 :QGPWLEEEEEAYGWMDFG RRSAEDEN(SEQ ID N0:27)。用于獲得C端抗-PG單克隆抗體的包含此抗原的示例性免疫原 描述于表1B和實(shí)施例部分中。
[0020] 對(duì)于一些用途，希望得到對(duì)hPG具有高親和力的抗-hPG單克隆抗體。對(duì)于某些用 途，如治療用途，希望得到至少約100nM的親和力，雖然可以希望得到具有更高親和力的抗 體，例如至少約 90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、 5nM、4nM、3nM、2nM、lnM、0. lnM、0.0 lnM或甚至更高的親和力。本文公開的多種具體的示例 性抗-PG單克隆抗體顯示從1(T6至1(T 12M的范圍內(nèi)的親和力（見表6)。具有尤其適合于 所希望的具體應(yīng)用的親和力的抗-PG單克隆抗體可以容易地從這些中選擇，或者用多種免 疫原、互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)序列、可變重鏈V H和可變輕鏈序列及本文所述方法來產(chǎn)生或設(shè) 計(jì)?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知或本文所述的技術(shù)測(cè)定任意具體的抗-PG單克隆抗體的親和力，例 如ELISA、等溫滴定量熱法（ITC)、BIAcore或熒光偏振測(cè)定。
[0021] hPG是相對(duì)小的多肽，長(zhǎng)度僅為80個(gè)氨基酸。預(yù)期以相對(duì)高的親和力（例如至少 約10nM)特異性結(jié)合hPG的任意單克隆抗體都將干擾PG與它的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)發(fā)放配偶 體相互作用的能力，從而抑制CRC細(xì)胞的增殖。但是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，并非所有抗-PG單克隆抗 體都是中和性的（即，并非所有結(jié)合PG的單克隆抗體都干擾或抑制其生物信號(hào)發(fā)放活性）。 實(shí)際上，如將在實(shí)施例部分中更詳細(xì)地討論，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，一些抗-PG單克隆抗體雖然對(duì)PG 顯示高特異性和高親和力，但不中和PG。例如，如下文實(shí)施例部分中詳述，抗-hPG MAB14以 約6pM的KD結(jié)合hPG，但不抑制體外CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)。特異性結(jié)合hPG的非中和性單克隆 抗體用于診斷目的，而中和PG的那些抗-hPG單克隆抗體尤其適合于治療CRC的治療應(yīng)用。
[0022] 本文所用的"中和性抗-hPG單克隆抗體"是這樣的單克隆抗體，與用非特異性單 克隆抗體處理的對(duì)照樣品相比，其產(chǎn)生抗-hPG單克隆抗體處理的測(cè)試樣品中存活CRC細(xì)胞 數(shù)目的統(tǒng)計(jì)上顯著的減少。用于評(píng)估任意具體的抗-hPG單克隆抗體中和hPG的能力的具 體測(cè)定描述于下文發(fā)明詳述部分中。雖然預(yù)期在此測(cè)定中顯示中和活性（例如活細(xì)胞數(shù)目 統(tǒng)計(jì)上顯著地減少40%、30%、20%、15%或甚至10%)的抗-他6單克隆抗體也提供治療 益處，但認(rèn)為在此測(cè)定中顯示使活細(xì)胞數(shù)目減少至少約50%的那些抗-hPG單克隆抗體在 治療CRC中尤其有用。
[0023] 因此，在一些實(shí)施方案中，抗-PG單克隆抗體是中和性抗-PG單克隆抗體。已發(fā)現(xiàn)， 抗-PG單克隆抗體中和PG的能力不是表位依賴性的。如實(shí)施例部分中所示例，N端和C端 抗-PG抗體都具有中和活性。因此，在一些實(shí)施方案中，中和性抗-PG單克隆抗體是N端中 和性抗體，在其他實(shí)施方案中，抗-PG單克隆抗體是C端中和性抗體。
[0024] 表位定位顯示，即使在針對(duì)同一免疫原產(chǎn)生時(shí)，N端抗-PG單克隆抗體也并非全都 結(jié)合相同的表位。C端抗-hPG單克隆抗體的情況也是這樣。實(shí)施例部分中的表8和9中 提供了通過丙氨酸掃描和SPOT技術(shù)鑒定的示例性N端和C端抗-hPG單克隆抗體結(jié)合的表 位。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含對(duì)應(yīng)于hPG N端部分的氨基酸序 列的表位。在具體實(shí)施方案中，N端抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含hPG的殘基10至14 (SEQ ID NO :28)、hPG 的殘基 9 至 14 (SEQ ID NO :29)、hPG 的殘基 4 至 10 (SEQ ID NO :30)、hPG 的殘基2至10 (SEQ ID NO : 31)或hPG的殘基2至14 (SEQ ID NO : 32)的表位。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含對(duì)應(yīng)于hPG C端區(qū)域部分的氨 基酸序列的表位。在具體實(shí)施方案中，C端抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含hPG的殘基71至 74 (SEQ ID NO :33)、hPG 的殘基 69 至 73 (SEQ ID NO :34)、hPG 的殘基 76 至 80 (SEQ ID NO : 35)或hPG的殘基67至74 (SEQ ID NO :36)的表位。
[0027] 預(yù)期可以互換結(jié)合大致相同的表位的抗-hPG單克隆抗體的對(duì)應(yīng)的CDR和/或V H 和 '鏈來產(chǎn)生新的抗-hPG單克隆抗體。例如，如表9中所指出，示例性抗-hPG單克隆抗 體MAb 5和MAb 6結(jié)合相同的表位?？梢栽O(shè)計(jì)在其 '鏈中包含這兩種抗體的⑶R的多 種組合和/或在其￥11鏈中包含這兩種抗體的VH 的多種組合的抗-hPG單克隆抗體。作 為說明多種可能的組合的具體實(shí)例，這種抗體可以在其'鏈中包含MAb 5的CDR 1和2(分 別為 ' CDR1. 5 和 ' CDR2. 5)及 MAb 6 的 CDR 3 ('CDR3. 6)，在其 ￥11鏈中包含 MAb 6 的 CDR 1 (VH CDR1. 6)及 MAb 5 的 CDR 2 和 3 (分別為 VH CDR2. 5 和 VH CDR3. 5)。
[0028] 已鑒定了幾種對(duì)hPG具有高特異性和親和力并在體外測(cè)定中顯示良好的抗腫瘤 活性的抗-hPG單克隆抗體，且在一些情況下測(cè)定了它們的CDR的序列，它們的的 序列，和/或提出用于人源化形式的％和八鏈的序列。還保藏了幾種雜交瘤。發(fā)明詳述部 分中更詳細(xì)地描