一種雙靶點雙彈頭抗腫瘤融合蛋白、其編碼基因和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥用蛋白技術(shù)領(lǐng)域。具體來講，本發(fā)明涉及一種抗腫瘤融合蛋白、其編 碼基因、以該融合蛋白為活性成分的藥物以及其制藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘 導(dǎo)配體）是機(jī)體自身合成的一種細(xì)胞因子，其生理功能主要是調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。TRAIL 主要通過細(xì)胞外凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在后期也有線粒體通路的參與。TRAIL信號傳導(dǎo) 通路是指以TRAIL為配體，通過與死亡受體結(jié)合而啟動凋亡信號，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究 表明，TRAIL及靶向TRAIL受體的激動劑型抗體能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而正常組 織并不敏感。
[0003] TRAIL對腫瘤細(xì)胞具有選擇性作用，目前已經(jīng)發(fā)展到II期臨床試驗階段，并且預(yù)示 了很好的臨床應(yīng)用前景。大量研究已經(jīng)表明，TRAIL能誘導(dǎo)各種腫瘤細(xì)胞凋亡，如肺癌、乳 腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、胸腺腫瘤、白血病、多發(fā)性骨髓 瘤、黑色素瘤、骨肉瘤等。盡管早期的臨床實驗是很令人鼓舞的，但是人重組表達(dá)的TRAIL (Human recombinant TRAIL, hrTRAIL)僅僅局限于攜帶TRAIL敏感腫瘤的患者，即使同一 組織來源的腫瘤，對TRAIL的敏感性也有差異。因此，不同腫瘤組織對TRAIL的不敏感性使 TRAIL應(yīng)用于臨床受到限制。然而，研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL與小分子藥物聯(lián)用后，不但可以克服腫 瘤對TRAIL的耐藥性，同時還可以增加療效。
[0004] 表皮生長因子受體（EGFR)異常表達(dá)是多種上皮來源的腫瘤細(xì)胞的重要特性，因此 EGFR已成為腫瘤靶向性治療的理想靶點。EGFR過度表達(dá)能夠拮抗死亡配體TRAIL和⑶95L 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。如果采用針對EGFR的配體片段融合蛋白拮抗EGFR介導(dǎo)的信號通路， 那么就能增強TRAIL的抗腫瘤作用，并能在一定程度上克服腫瘤細(xì)胞對TRAIL的耐藥性。
[0005] 力達(dá)霉素（LDM)是由1個輔基蛋白（Lidamycin apoprotein, LDP)和1個發(fā)色團(tuán) (active enediyne chromophore,AE)組成的一種烯二炔類抗腫瘤抗生素，可以作為彈頭藥 物。其中，輔基蛋白起保護(hù)發(fā)色團(tuán)的作用，由110個氨基酸組成，分子量為10506Da，并且這 兩個部分可以拆分。研究發(fā)現(xiàn)，LDP本身在體內(nèi)具有中等程度的抗腫瘤作用，并且由于其具 有獨特的分子結(jié)構(gòu)，可以作為開發(fā)新型抗腫瘤藥物的支架載體。
[0006] 基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況，可以考慮以力達(dá)霉素輔基蛋白為支架載體，通過基因工 程的方法將TRAIL和EGFR配體寡肽與力達(dá)霉素輔基蛋白形成融合蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種以LDP為支架具有靶向EGFR和 DR4/DR5的雙特異性融合蛋白，該融合蛋白為具有抗腫瘤作用的小分子藥用蛋白。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是提供該融合蛋白的編碼基因。
[0009] 由于力達(dá)霉素具有可拆分和組裝的特性，本發(fā)明還提供一種與發(fā)色團(tuán)組裝的強化 融合蛋白。
[0010] 本發(fā)明的還一個目的是提供以上述融合蛋白為活性成分的藥物以及上述融合蛋 白的制藥用途。
[0011] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：
[0012] 目前研究表明，TRAIL主要通過與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活細(xì)胞凋亡路 徑而發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡的作用。有研究表明該機(jī)制和EGFR通路在上皮來源的細(xì)胞中相互作 用緊密。如果能夠拮抗EGFR介導(dǎo)的信號通路，那么就能增強TRAIL的抗腫瘤作用，并且在一 定程度上可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的耐藥性。本研究的目標(biāo)是構(gòu)建一種靶向EGFR和DR4/ DR5的雙特異性融合蛋白，融合蛋白含有靶向EGFR的配體寡肽，通過拮抗EGFR信號通路來 增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對TRAIL的天然耐藥性。此外，因力達(dá)霉素 具有可拆分和組裝的特性，本發(fā)明人還成功組裝了一種新的雙靶點強化融和蛋白，該雙特 異性強化融合蛋白由三部分組成：兩個分別靶向EGFR和DR4/DR5的寡肽配體作為導(dǎo)向分 子，力達(dá)霉素作為"彈頭"藥物，旨在利用導(dǎo)向分子的特異性將力達(dá)霉素分子帶入腫瘤細(xì)胞 中，而且由于配體的靶向性和TRAIL的選擇性作用而提高力達(dá)霉素對腫瘤細(xì)胞的選擇性， 從而降低力達(dá)霉素的副作用，同時，TRAIL具有靶向和"彈頭"的雙重作用，希望為抗腫瘤靶 向藥物的研制提供一種新的探索。
[0013] 因此，一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一級氨基 酸序列結(jié)構(gòu)：
[0014] EGFR特異性把向寡肽-連接肽-力達(dá)霉素輔基蛋白-連接肽-TRAIL功能肽段；
[0015] 其中，所述EGFR特異性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22個氨 基酸；所述力達(dá)霉素輔基蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110個氨基酸；所述 TRAIL功能肽段具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共168個氨基酸。在本文中，將具有 上述結(jié)構(gòu)的融合蛋白命名為"Ec-LDP-TRAIL"。
[0016] 在該融合蛋白中，連接肽優(yōu)選為（GGGGS)2。選擇（GGGGS)2作為連接肽的原因在于， 一方面利于在工程菌如大腸桿菌中表達(dá)；另一方面，連接肽太短，剛性大，不利于蛋白分子 伸展，容易造成蛋白分子構(gòu)象相互遮掩，影響蛋白功能，并且力達(dá)輔基蛋白（LDP)支架分子 共110個氨基酸，具有a螺旋和0折疊，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量比較大，因此，選用（GGGGS) 2。
[0017] 所述融合蛋白具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
[0018] 優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5所示。
[0019] SEQ ID N0:4為本發(fā)明提供的一個融合蛋白的氨基酸序列，共320個氨基酸。從 氨基端至羧基端，該融合蛋白包括：EGFR特異性靶向寡肽（Ec)，共22個氨基酸；連接肽，為 (GGGGS) 2柔性肽，共10個氨基酸；力達(dá)霉素輔基蛋白（LDP)，共110個氨基酸；連接肽，為 (GGGGS)2柔性肽，共10個氨基酸；TRAIL功能肽段，共168個氨基酸。
[0020] SEQ ID N0:5為本發(fā)明提供的一個融合蛋白的氨基酸序列，共330個氨基酸。相比 于SEQ ID N0:4,該融合蛋白在EGFR特異性靶向寡肽之前具有His和Met，在TRAIL功能肽 段的C端具有Leu和Glu以及（His) 6標(biāo)簽。
[0021] 另一方面，本發(fā)明提供上述融合蛋白的編碼基因。
[0022] 所述編碼基因具有SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；或者，所述編碼基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
[0023] 優(yōu)選地，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。
[0024] 再一方面，本發(fā)明提供一種抗腫瘤強化融合蛋白，所述強化融合蛋白為本發(fā)明的 上述融合蛋白與力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)組裝而成，此強化融合蛋白具有TRAIL和力達(dá)霉素兩個彈 頭。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】，所述強化融合蛋白通過包括以下步驟的方法組裝而 成：將所述的融合蛋白與力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)以1:5的摩爾比混合，于4°C下避光緩慢晃動反應(yīng) 12~16個小時。反應(yīng)結(jié)束后，去除多余發(fā)色團(tuán)，得到組裝成功的強化融合蛋白。根據(jù)本發(fā) 明的【具體實施方式】，將混合液用ro-10柱(商業(yè)化的SephadexG-25柱，Pharmacia產(chǎn)品)層 析分離，經(jīng)280nm、343nm紫外監(jiān)測后，棄去過量未反應(yīng)的AE，收集強化融合蛋白。
[0026] 另一方面，本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物，所述藥物以本發(fā)明提供的上述融合蛋 白和/或強化融合蛋白為活性成分。所述抗腫瘤藥物用于治療或預(yù)防哺乳動物的鱗狀上皮 細(xì)胞癌；優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
[0027] 又一方面，本發(fā)明還提供上述融合蛋白或強化融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用 途。所述抗腫瘤藥物用于治療或預(yù)防哺乳動物的鱗狀上皮細(xì)胞癌；優(yōu)選地，所述哺乳動物是 人。
[0028] 綜上，本發(fā)明應(yīng)用基因工程的方法提供了一種新型的具有特異性、靶向性的融合 蛋白。該融合蛋白以力達(dá)霉素輔基蛋白為支架載體，融合了 TRAIL和EGFR配體寡肽，是靶 向兩種受體（EGFR，DR4/DR5)的雙特異性融合蛋白。這種雙特異性融合蛋白的導(dǎo)向分子為 EGFR寡肽配體和DR4/DR5專一配體的可溶部分（sTRAIL)，且寡肽配體和sTRAIL位于同一 個分子上，使該融合蛋白具有較好的體內(nèi)外抗腫瘤作用。
[0029] 本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果在于，應(yīng)用基因工程技術(shù)制備獲得的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL，可特異地與腫瘤細(xì)胞表面的EGFR受體和DR4/DR5結(jié)合，并能抑制腫瘤細(xì)胞 的增殖，在體內(nèi)也能明顯抑制裸鼠移植瘤的生長。此外，融合蛋白均具有較低的藥物毒性， 具有發(fā)展成腫瘤靶向性治療藥物的潛能。
[0030] 本發(fā)明所提供的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL其制備方法包括以下步驟：
[0031] 融合蛋白Ec-LDP-TRAIL重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；
[0032] 融合蛋白Ec-LDP-TRAIL在大腸埃