一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域融合蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于融合蛋白領(lǐng)域，特別涉及一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域融合蛋 白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] C_Met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor, HGF)已知的惟一受體，也 是一類具有自身磷酸化活性的跨膜受體，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。臨 床研究發(fā)現(xiàn)，C-Met的過(guò)量表達(dá)可見(jiàn)于在我國(guó)發(fā)病率較高的肺癌、肝癌、大腸癌、乳腺癌中， 并與腫瘤惡性化程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后呈正相關(guān)。C-Met主要包括三個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域：胞外 區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。C-Met胞外區(qū)（Extracellular domain, ED)包含一個(gè)信號(hào)素軸向蛋 白樣的結(jié)構(gòu)域、一個(gè)富含Cys的PSI區(qū)域以及四個(gè)免疫球蛋白-plexin-轉(zhuǎn)錄因子同源結(jié) 構(gòu)組成的IPT1-4結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)區(qū)則包含一個(gè)近膜區(qū)、一個(gè)酪氨酸激酶區(qū)和一個(gè)C-末端序 列。ED作為配體識(shí)別部位識(shí)別并結(jié)合HGF，對(duì)后續(xù)發(fā)生的一系列生物調(diào)節(jié)效應(yīng)具有重要作 用。近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，C-Met胞外區(qū)中的IPT3-4結(jié)構(gòu)域也是C-Met與HGF結(jié)合的關(guān)鍵結(jié) 構(gòu)域。HGF與ED結(jié)合使其構(gòu)象發(fā)生改變，磷酸化激活胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 的增殖、遷徙和血管生成，最終導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞侵入正常組織，穿透臟器組織層，最終擴(kuò) 散至全身。一旦腫瘤細(xì)胞中異?；罨腍GF/C-Met信號(hào)通路被阻斷，腫瘤細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)細(xì) 胞增殖減緩、成瘤性降低、侵襲能力下降等一系列變化。阻斷HGF/C-Met信號(hào)通路的酪氨酸 激酶抑制劑cabozantinib已于2012年獲FDA批準(zhǔn)用于晚期甲狀腺髓樣癌的治療。目前， 還沒(méi)有FDA批準(zhǔn)的抗C-Met的中和抗體藥物。
[0003] 中和性抗體因其特異性強(qiáng)、副作用小等特點(diǎn)，在多種腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。中 和性抗體不僅能與相應(yīng)抗原受體特異性結(jié)合，還能有效中和配體對(duì)受體的作用，具有發(fā)展 成為治療性抗體藥物的潛力，在人類疾病治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如經(jīng)FDA批準(zhǔn)治療乳腺癌 的中和抗體類藥物曲妥珠單抗（trastuzumab)能特異性與人表皮生長(zhǎng)因子受體2結(jié)合，阻 斷配體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于治療結(jié)腸癌和肺癌的西妥昔單抗 (Cetuximab)也屬中和抗體類藥物，可以競(jìng)爭(zhēng)性的抑制EGFR及其配體的結(jié)合，進(jìn)而抑制腫 瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其調(diào)亡。
[0004] 所謂C-Met的中和抗體，就是能與C-Met結(jié)合，占據(jù)C-Met與HGF結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu) 域，阻止兩者結(jié)合，阻斷HGF/C-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)。而C-Met與HGF 結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域是其胞外區(qū)ED，特別是胞外區(qū)的IPT3-4結(jié)構(gòu)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域融合蛋 白及其應(yīng)用，該融合蛋白可特異性的與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合，在篩選阻斷C-Met/HGF信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)的中和抗體藥物研發(fā)方面具有重大作用。
[0006] 本發(fā)明的一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域融合蛋白，所述融合蛋白由表皮生 長(zhǎng)因子受體的強(qiáng)信號(hào)肽、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及His標(biāo)簽構(gòu)成；其中，肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子受體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域?yàn)榘鈪^(qū)ED(Extracellulardomain)或免疫球蛋白-plexin-轉(zhuǎn) 錄因子同源結(jié)構(gòu)域 3-4IPT34(Immunoglobulinplexintranscriptionfactorhomology Domains);ED的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示或是該序列的變體，ED的氨基酸序列如 SEQIDN0:2所示或是該序列的變體；IPT34的核苷酸序列如上述序列SEQIDN0:1中 2152-2724核苷酸序列所示或是該序列的變體，IPT34的氨基酸序列如上述序列SEQID NO:2中718-908氨基酸序列所示或是該序列的變體。
[0007] 所述表皮生長(zhǎng)因子受體的強(qiáng)信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序 列如SEQ ID N0:4所示。
[0008] 所述融合蛋白一共有940個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO:5所示，其中1-26位氨基酸是 表皮生長(zhǎng)因子受體的強(qiáng)信號(hào)肽，27-934位氨基酸是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體ED蛋白，935-940 位氨基酸是6 XHis標(biāo)簽。
[0009] 所述融合蛋白一共有223個(gè)氨基酸，如SEQ ID N0:6所示，其中1-26位氨基酸是表 皮生長(zhǎng)因子受體的強(qiáng)信號(hào)肽，27-217位氨基酸是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體IPT34蛋白，218-223 位氨基酸是6 XHis標(biāo)簽。
[0010] 編碼有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域融合蛋白的DNA的質(zhì)粒。
[0011] 編碼有肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)，包括在原核和真核細(xì)胞 的表達(dá)。
[0012] 所述融合蛋白與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合。
[0013] 本發(fā)明的一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域融合蛋白的應(yīng)用，所述融合蛋白用 于抗體制備。
[0014] 本發(fā)明C_Met胞外區(qū)（Extracellular domain, ED)包含一個(gè)信號(hào)素軸向蛋白樣的 結(jié)構(gòu)域、一個(gè)富含Cys的PSI區(qū)域以及四個(gè)免疫球蛋白-plexin-轉(zhuǎn)錄因子同源結(jié)構(gòu)組成的 1卩1'1-4結(jié)構(gòu)域。現(xiàn)有技術(shù)201110215692.8的1?1'4(：是由1?1'1-4組成，而本發(fā)明構(gòu)建的 IPT34只包括IPT3和IPT4。c-Met只有與HGF結(jié)合才會(huì)被激活，發(fā)揮功效。目前，c-Met胞 外區(qū)與HGF結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)還不清楚，IPT1-4被認(rèn)為是關(guān)鍵區(qū)域，本發(fā)明構(gòu)建的IPT34 近一步縮小了搜索范圍。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)201110215692. 8的融合蛋白相比，本發(fā)明更換了 c-MET本身的信號(hào) 肽，而用了表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)的強(qiáng)信號(hào)肽，此信號(hào)肽已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)多次，可實(shí)現(xiàn)融合 蛋白的胞外表達(dá)，并且不改變?nèi)诤系鞍椎娜S結(jié)構(gòu)。
[0016] 有益效果
[0017] (1)利用基因工程技術(shù)表達(dá)了 C-Met的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域ED和IPT34融合蛋白，該區(qū)域 是C-Met與其配體HGF結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，在其信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用。
[0018] (2)為使融合蛋白在293T細(xì)胞中高效表達(dá)，選用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，