陰道上皮細胞培養(yǎng)基及陰道上皮細胞培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種陰道上皮細胞培養(yǎng)基，以及陰道上皮細胞的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于陰道自身的結(jié)構(gòu)特點，直接與外環(huán)境接觸，性交過程等因素很容易接觸感染病原微生物，而陰道存在著自凈作用，并且作為第一道防線的上皮細胞在陰道先天免疫過程中發(fā)揮一定作用。研宄人員較容易地在醫(yī)院獲得來自正常個體或陰道炎癥患者的陰道上皮細胞。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，陰道上皮細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分比較復雜，配置不方便；目前市面上的陰道上皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒雖然操作簡單，但價格昂貴，操作繁瑣，不利于大批量的研宄實驗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對以上要解決的問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種陰道上皮細胞培養(yǎng)基，增加上皮細胞數(shù)量，減少成纖維細胞數(shù)量，改善細胞融合狀態(tài)。
[0004]本發(fā)明的另一個目的是提供一種陰道上皮細胞的培養(yǎng)方法，提高培養(yǎng)效率，降低陰道上皮細胞培養(yǎng)成本，簡化操作。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種陰道上皮細胞培養(yǎng)基。該陰道上皮細胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基；添加劑包括表皮生長因子、牛垂體提取物、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸、胎牛血清、青霉素-鏈霉素和霍亂菌素。
[0006]根據(jù)本發(fā)明的陰道上皮細胞培養(yǎng)基，其各組分的比例為:所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為47.2mL無血清培養(yǎng)基；所述添加劑包括8 μ L表皮生長因子、300 μ L牛垂體提取物、500 μ L胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸、1.5mL胎牛血清、500 μ L青霉素-鏈霉素和0.9 μ L霍亂菌素。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種陰道上皮細胞培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法采用本發(fā)明如上所述陰道上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)陰道上皮細胞。該培養(yǎng)方法是在培養(yǎng)的前三天禁止移動，第4天開始采用上述陰道上皮細胞培養(yǎng)基換液，第6-8天細胞開始融合，培養(yǎng)溫度為37。。。
[0008]應用本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的陰道上皮細胞培養(yǎng)基成分明確，通過該培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的上皮細胞數(shù)量多、成纖維細胞數(shù)量少、細胞融合狀態(tài)好，這對提高陰道上皮細胞原代培養(yǎng)細胞數(shù)具有重要意義。
【附圖說明】
[0009]圖1示出了實驗中實施例2的陰道上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠陰道上皮細胞第6天細胞開始融合的圖像；
[0010]圖2示出了上皮細胞特異的標志性角蛋白的廣譜角蛋白免疫熒光染色圖像。原代培養(yǎng)大鼠陰道上皮細胞的鑒定:a)光鏡下原代培養(yǎng)大鼠陰道上皮細胞；b)綠色熒光顯示原代培養(yǎng)的陰道上皮細胞特異性標記抗角蛋白的FITC免疫活性；c)未加一抗的陰性對照組光鏡下細胞圖；d)未加一抗的陰性對照組FITC熒光結(jié)果。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應用范圍。以下實施例所使用的成分均為市售商品。如未特別指出，實驗步驟中的部分操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定的常規(guī)操作，故不一一贅述。
[0012]實施例1
[0013]配制10mL儲備液，其中包括:(1)94.4mL無血清培養(yǎng)基；(2) 16 μ L表皮生長因子、(3) 600 μ L牛垂體提取物、(4) 1000 μ L胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸添加劑、(5)3mL胎牛血清、(6) 1000 μ L青霉素-鏈霉素(細胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素)和(7) 1.8 μ L霍亂菌素。
[0014]以上各組分混合均勻即得。
[0015]實施例2
[0016]陰道上皮細胞培養(yǎng):
[0017]實驗材料:雌性大鼠陰道組織
[0018]培養(yǎng)基:實施例1中的陰道上皮細胞培養(yǎng)基
[0019]實驗步驟:
[0020]S1:C02窒息處死處在動情間期的SD雌性大鼠，迅速取出陰道組織，立即浸泡在實施例I配制的含有1%青霉素-鏈霉素的陰道上皮細胞培養(yǎng)基中；修剪陰道組織，去除皮毛、脂肪、血管等；用含有1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液清洗修剪后的組織2-3次；將組織剪碎呈糜爛約30min ;膠原酶消化，移除上清液，再消化；225g離心；棄上清，加入陰道上皮細胞培養(yǎng)基完全培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，接種在6孔板中。
[0021]S2:37°C,95% C02/5% O2恒溫恒濕培養(yǎng)，3天內(nèi)禁止移動孔板。
[0022]S3:3天后首次換液，此后每2天換一次培養(yǎng)基。
[0023]如圖1所示，圖像顯示，實施例2的陰道上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠陰道上皮細胞在第6天細胞開始融合。
[0024]圖2示出了上皮細胞特異的標志性角蛋白的廣譜角蛋白免疫熒光染色圖像。
[0025]由圖1和圖2可見，用此培養(yǎng)液培養(yǎng)第六天的陰道上皮細胞。圖1顯示細胞生長良好，數(shù)目多，細胞團完全散開貼壁，細胞之間可以形成上皮細胞特有的緊密連接。為了進一步證實得到的原代培養(yǎng)細胞是上皮細胞，用綠色熒光FITC對上皮細胞特異性標記蛋白角蛋白進行標記，利用免疫熒光的方法鑒定所得到上皮細胞的純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)成片存在的細胞都有綠色熒光(圖2a，b)，細胞群落中偶爾散布成纖維細胞，上皮細胞的比例在95%以上。而在沒有加一抗，只加了二抗的陰性對照中(圖2c，d)，綠色熒光不能檢測到，說明圖2b中的綠色熒光為角蛋白特異發(fā)出，此鑒定方法可靠。
[0026]由此可見，通過本發(fā)明的陰道上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的上皮細胞數(shù)量多、成纖維細胞數(shù)量少、細胞融合狀態(tài)好，有助于提高陰道上皮細胞原代培養(yǎng)細胞數(shù)。
【主權(quán)項】
1.一種陰道上皮細胞培養(yǎng)基，其特征在于包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑；其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基；所述添加劑包括表皮生長因子、牛垂體提取物、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸、胎牛血清、青霉素-鏈霉素和霍亂菌素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的陰道上皮細胞培養(yǎng)基，其特征在于其各組分的比例為:所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為47.2mL無血清培養(yǎng)基；所述添加劑包括8 μ L表皮生長因子、300 μ L牛垂體提取物、500 μ L胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸、1.5mL胎牛血清、500 μ L青霉素-鏈霉素和0.9 μ L霍亂菌素。
3.一種陰道上皮細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求1或2所述的陰道上皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟:培養(yǎng)的前三天禁止移動，第四天開始換液，然后采用權(quán)利要求1或2所述的陰道上皮細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 °C。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種陰道上皮細胞培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑；其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基；所述添加劑包括表皮生長因子、牛垂體提取物、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、胎牛血清、青霉素-鏈霉素和霍亂菌素。本發(fā)明還提供了一種陰道上皮細胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明的陰道上皮細胞培養(yǎng)基成分明確，通過該培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的上皮細胞數(shù)量多、成纖維細胞數(shù)量少、細胞融合狀態(tài)好。
【IPC分類】C12N5-071
【公開號】CN104630134
【申請?zhí)枴緾N201510085157
【發(fā)明人】葉中華, 周文良, 朱蘊馨, 劉雯, 楊登亮, 黃潔虹
【申請人】葉中華, 周文良
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月15日