低血清培養(yǎng)st細(xì)胞生產(chǎn)豬瘟c株病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬癌C株病毒 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ST細(xì)胞系豬睪丸（swine testis)細(xì)胞，體外培養(yǎng)呈貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)過程中增殖較 為緩慢，且細(xì)胞消化傳代中容易成團(tuán)。ST細(xì)胞對(duì)多種病毒比較敏感，如豬癌病毒（CSFV)、豬 細(xì)小病毒（PPV)、偽狂犬病毒等。目前，培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)疫苗多采用轉(zhuǎn)瓶工藝，使用DMEM、 MEM培養(yǎng)基添加10 %的血清培養(yǎng)。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)豬癌疫苗生產(chǎn)技術(shù)不論是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)，還是先進(jìn)的生物反應(yīng) 器息浮培養(yǎng)技術(shù)，均采用高血清含量細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。該傳統(tǒng)工藝效率低、生產(chǎn)成本高；不同 血清批次間差異顯著；放大重現(xiàn)性較差；對(duì)下游純化工藝要求高；容易出現(xiàn)血清出復(fù)雜成 分導(dǎo)致的疫苗質(zhì)量隱患，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。另外，目前全球血清供應(yīng)趨緊，該 大大影響了疫苗企業(yè)的生產(chǎn)效率。因此低血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用勢(shì)在必行。經(jīng)檢索，未有關(guān) 于低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬癌C株病毒的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬癌C株病 毒的方法，該方法可W顯著降低生產(chǎn)成本，同時(shí)可W提高下游純化的效率，并且能夠快速穩(wěn) 定的擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。
[0005] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)；低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬癌C株病毒的 方法，它包括W下步驟：
[000引 S1.巧[J備用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：
[0007] 取T75瓶培養(yǎng)鋪滿單層ST細(xì)胞，經(jīng)邸TA-膜酶細(xì)胞分散液消化細(xì)胞，用細(xì)胞生長(zhǎng) 液吹打分散細(xì)胞，加入20ml細(xì)胞生長(zhǎng)液，將ST細(xì)胞置于溫度為37 +2°C的二氧化碳培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)72h，待形成良好的細(xì)胞單層時(shí)，進(jìn)行放大培養(yǎng)，上述細(xì)胞生長(zhǎng)液為10%血清含量的 DMHM或MHM培養(yǎng)液；
[0008] S2.馴化細(xì)胞適應(yīng)低血清培養(yǎng)基：包括W下子步驟：
[0009] S21.第一代細(xì)胞的馴化：
[0010] 將步驟S1擴(kuò)大培養(yǎng)的ST細(xì)胞接種到第一代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第一 代低血清培養(yǎng)基為含10 %血清的DMEM或MEM培養(yǎng)液和含5 %血清的默克MD低血清培養(yǎng) 液的混合液，DMEM或MEM培養(yǎng)液與默克MD低血清培養(yǎng)液體積比為2:1，其中血清的含量為 8. 3% ；
[0011] S22.第二代細(xì)胞的馴化：
[0012] 將馴化的第一代ST細(xì)胞接種到第二代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第二代低 血清培養(yǎng)基為含10%血清的DMEM或MEM培養(yǎng)液和含5%血清的默克MD低血清培養(yǎng)液的混 合液，DMEM或MEM培養(yǎng)液與默克MD低血清培養(yǎng)液體積比為1: 1，其中血清的含量為7. 5% ;
[0013] S23.第H代細(xì)胞的馴化：
[0014] 將馴化的第二代ST細(xì)胞接種到第H代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第H代低 血清培養(yǎng)基為含10%血清的DMEM或MEM培養(yǎng)液和含5%血清的默克MD低血清培養(yǎng)液的混 合液，DMEM或MEM培養(yǎng)液與默克MD低血清培養(yǎng)液體積比為1:2,其中血清的含量為6. 7% ;
[0015] S24.第四代細(xì)胞的馴化：
[0016] 將馴化的第H代ST細(xì)胞接種到第四代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第四代低 血清培養(yǎng)基為默克MD低血清培養(yǎng)基和血清的混合液，血清的含量為5% ;
[0017] S3.馴化細(xì)胞適應(yīng)低血清培養(yǎng)環(huán)境：
[0018] 使用T75細(xì)胞瓶，37C靜態(tài)培養(yǎng)馴化的第四代ST細(xì)胞，培養(yǎng)液為默克MD低血清培 養(yǎng)基和血清的混合液，血清的含量為1~5%，即為生產(chǎn)用種子細(xì)胞；
[0019] S4.細(xì)胞毒種的繁殖：
[0020] 用病毒培養(yǎng)液將豬癌C株病毒種毒按0. 5~1% (v/v)的比例接種到生產(chǎn)用種子 細(xì)胞單層中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)7化后收獲毒液；將此毒液作為種毒，在生產(chǎn)用細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞 適應(yīng)性連續(xù)傳代，直至TCIDg。穩(wěn)定，此時(shí)收獲的毒液作為生產(chǎn)用種毒；
[0021] S5.制備毒液的繁殖：
[0022] 待生產(chǎn)用種子細(xì)胞形成單層，按0. 5~1% (v/v)的比例接入生產(chǎn)用種毒，置于培 養(yǎng)溫度為37°C、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種后72h收獲病毒。
[0023] 進(jìn)一步地，所述邸TA-膜酶細(xì)胞分散液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 10~0. 25 %的膜酶和 0. 02%的邸TA的Hank' S液的混合液。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟S1中所述細(xì)胞生長(zhǎng)液為低血清培養(yǎng)基和血清的混合液，其中血清 的含量為1~5%。
[00巧]進(jìn)一步地，步驟S4和S5中所述的病毒毒種培養(yǎng)液為低血清培養(yǎng)基、血清和抗生素 的混合液，其中，血清的含量為0~1%，抗菌素的含量為100~200IU/mL，且混合液的抑 值為7. 2~7.4。
[0026] 上述技術(shù)方案中，低血清培養(yǎng)基為默克MD系列干粉低血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在使用 前，需按照說明書配成溶液，具體方法如下：1)將一袋培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注 射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水（水溫2(TC~3(TC)到17. 5升，輕 微攬拌溶解；2)加入23克碳酸氨軸；3)輕微攬拌溶解，加注射用水至20升；4)如果必要， 用Imol/L氨氧化軸溶液或Imol/L鹽酸溶液調(diào)抑至7. 2-7. 4 ;5)用0. 2 y m濾膜正壓過濾 除菌；6)溶液應(yīng)在2C -8C下避光保存。
[0027] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬癌C株病毒生產(chǎn)疫苗中使 用低血清培養(yǎng)基可有效降低培養(yǎng)液中的牛血清使用量，并能提高細(xì)胞密度及生物制品的產(chǎn) 率；本發(fā)明ST細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況甚至優(yōu)于加入10%牛血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基，且 能提高細(xì)胞密度、提高病毒滴度，獲取同樣的細(xì)胞量，用低血清培養(yǎng)基將比用傳統(tǒng)培養(yǎng)基縮 短近1/3的時(shí)間，可提高生產(chǎn)效率。因此，本發(fā)明提供低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬癌C株病 毒的方法可W顯著降低生產(chǎn)成本，同時(shí)可W提高下游純化的效率，并且能夠快速穩(wěn)定的擴(kuò) 大生產(chǎn)規(guī)模，質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。
【附圖說明】
[002引圖巧實(shí)施例3中血清添加比例為1%時(shí)ST細(xì)胞的生長(zhǎng)效果圖，其中，圖a的培養(yǎng) 時(shí)間為2化，圖b的培養(yǎng)時(shí)間為48h，圖C的培養(yǎng)時(shí)間為72h ;
[002引圖2為實(shí)施例3中血清添加比例為2%時(shí)ST細(xì)胞的生長(zhǎng)效果圖，其中，圖a的培養(yǎng) 時(shí)間為2化，圖b的培養(yǎng)時(shí)間為48h，圖C的培養(yǎng)時(shí)間為72h ;
[0030] 圖3為實(shí)施例3中血清添加比例為3%時(shí)ST細(xì)胞的生長(zhǎng)效果圖，其中，圖a的培養(yǎng) 時(shí)間為2化，圖b的培養(yǎng)時(shí)間為48h，圖C的培養(yǎng)時(shí)間為72h ;
[003。 圖4為實(shí)施例3中血清添加比例為4%時(shí)ST細(xì)胞的生長(zhǎng)效果圖，其中，圖a的培養(yǎng) 時(shí)間為2化，圖b的培養(yǎng)時(shí)間為48h，圖C的培養(yǎng)時(shí)間為72h ;
[003引圖5為實(shí)施例3中血清添加比例為5%時(shí)ST細(xì)胞的生長(zhǎng)效果圖，其中，圖a的培養(yǎng) 時(shí)間為2化，圖b的培養(yǎng)時(shí)間為48h，圖C的培養(yǎng)時(shí)間為72h ;
[003引圖6為實(shí)施例3中對(duì)照組ST細(xì)胞的生長(zhǎng)效果圖，其中，圖a的培養(yǎng)時(shí)間為2化，圖 b的培養(yǎng)時(shí)間為4她，圖C的培養(yǎng)時(shí)間為72h ;
[0034] 圖7為實(shí)施例4中低血清培養(yǎng)液馴化的ST細(xì)胞接種豬癌病毒后病變情況，其中， 圖a的血清添加比例為1%，圖b的血清添加比例為2%，圖C的血清添加比例為3%，圖d 為對(duì)照組，圖e的血清添加比例為4%，圖f的血清添加比例為5%。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于W下所 述。
[0036] 實(shí)施例1 ;低血清培養(yǎng)ST細(xì)胞生產(chǎn)豬癌C株病毒的方法，它包括W下步驟：
[0037] S1.巧[J備用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：
[0038] 取T75瓶培養(yǎng)鋪滿單層ST細(xì)胞，經(jīng)邸TA-膜酶細(xì)胞分散液消化細(xì)胞，邸TA-膜酶 細(xì)胞分散液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 15 %的膜酶和0. 02 %的邸TA的Hank' S液的混合液；用細(xì)胞 生長(zhǎng)液吹打分散細(xì)胞，加入20ml細(xì)胞生長(zhǎng)液，將ST細(xì)胞置于溫度為37 +2°C的二氧化碳培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，待形成良好的細(xì)胞單層時(shí)，進(jìn)行放大培養(yǎng)，上述細(xì)胞生長(zhǎng)液為10%血清含 量的DMEM培養(yǎng)液；
[0039] S2.馴化細(xì)胞適應(yīng)低血清培養(yǎng)基：包括W下子步驟：
[0040] S21.第一代細(xì)胞的馴化：
[0041] 將步驟S1擴(kuò)大培養(yǎng)的ST細(xì)胞接種到第一代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第一 代低血清培養(yǎng)基為含10%血清的DMEM培養(yǎng)液和含5%血清的默克MD低血清培養(yǎng)液的混合 液，DMEM培養(yǎng)液與默克MD低血清培養(yǎng)液體積比為2:1，其中血清的含量為8. 3% ;
[0042] S22.第二代細(xì)胞的馴化：
[0043] 將馴化的第一代ST細(xì)胞接種到第二代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第二代低 血清培養(yǎng)基為含10%血清的DMEM培養(yǎng)液和含5%血清的默克MD低血清培養(yǎng)液的混合液， DMEM培養(yǎng)液與默克MD低血清培養(yǎng)液體積比為1: 1，其中血清的含量為7. 5% ;
[0044] S23.第H代細(xì)胞的馴化：
[0045] 將馴化的第二代ST細(xì)胞接種到第H代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第H代低 血清培養(yǎng)基為含10%血清的DMEM培養(yǎng)液和含5%血清的默克MD低血清培養(yǎng)液的混合液， DMEM培養(yǎng)液與默克MD低血清培養(yǎng)液體積比為1:2,其中血清的含量為6. 7% ;
[0046] S24.第四代細(xì)胞的馴化：
[0047] 將馴化的第H代ST細(xì)胞接種到第四代低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，所述第四代低 血清培養(yǎng)基為默克MD低