海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]γ -內(nèi)酰胺酶(y-lactamses，EC 3.5.2.-)是催化酰胺類化合物酰胺鍵水解的一種新型酰胺酶。(+) γ -內(nèi)酰胺酶能夠高效率動(dòng)力學(xué)拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學(xué)純的(_) γ -內(nèi)酰胺。光學(xué)純的(-)γ -內(nèi)酰胺是制備抗病毒藥物的手性中間體，是抗艾滋病藥物(_)阿巴卡韋和(-)卡巴韋的合成原料，也是抗流感藥物帕拉米韋的合成原料。此外，γ-內(nèi)酰胺酶催化外消旋體γ-內(nèi)酰胺還可獲得不同構(gòu)型的γ-氨基丁酸類似物(GABA)。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動(dòng)，具有很高的生理活性(王建軍等，微生物學(xué)報(bào)，2010)。人們?cè)诎l(fā)現(xiàn)(+) γ-內(nèi)酰胺酶之前，常規(guī)方法制備光學(xué)純的(-)γ-內(nèi)酰胺一般采用不對(duì)稱合成的方法，此方法的缺點(diǎn)是原料昂貴、工藝繁瑣、生產(chǎn)成本高、造成環(huán)境污染，不利于工業(yè)化生產(chǎn)(Velazquez F., Current Organic Chemistry, 2002) ο運(yùn)用γ -內(nèi)酰胺酶進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)(-)γ -內(nèi)酰胺，具有反應(yīng)條件溫和、工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、環(huán)境友好、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶的研宄處于γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌株的選育和產(chǎn)酶條件優(yōu)化(Taylor SJC, et al.Journal oftheChemical Society:Chemical Communicat1ns, 1990 ;李海泉等，微生物學(xué)報(bào)，2006 ;陳紅干等，中國(guó)生物工程雜志，2012等)、酶學(xué)性質(zhì)以及相關(guān)基因克隆(Wang JJ, et al.Annalsof Microb1logy, 2009 ；Qin XX,et al.Appl B1chem B1technol, 2010 ；Yang M, etal.B1technology Letters, 2012等)階段，且集中于中溫γ -內(nèi)酰胺酶。低溫γ-內(nèi)酰胺酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，可減少加工工藝，縮短加工過(guò)程的時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用，在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)(朱非等，微生物學(xué)報(bào)，2002)，因此，低溫γ -內(nèi)酰胺酶上述特性將有助于其推廣和應(yīng)用，具有更廣闊的工業(yè)開發(fā)價(jià)值與市場(chǎng)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。低溫γ -內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用將對(duì)生物酶法拆分制備(-)γ -內(nèi)酰胺工業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。目前國(guó)內(nèi)外還未見海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法，該方法主要是海洋微生物經(jīng)過(guò)低溫馴化后，在10?16°C液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶的方法，這種生產(chǎn)方法獲得的低溫γ -內(nèi)酰胺酶，如再經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。本發(fā)明所述的一種海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶的方法具體包括以下步驟:
[0004](I)將能產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種活化，再逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C—25°C —22°C —20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，當(dāng)菌種在低溫環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)即馴化結(jié)束；該菌種的低溫馴化培養(yǎng)基為:酵母膏0.2?5.0g, N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0?
10.0g，NH4C12.0 ?15.0g，Na2HPO40.1 ?1.0g，NaH2PO40.1 ?1.0g,MgSO40.05 ?0.5g，瓊脂粉20g，自來(lái)水1.0L, pH為6.0?8.0，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0005]所述的能產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶的菌種來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，菌種編號(hào):1.761或1.647或1.1830 ；
[0006](2)按常規(guī)方法將步驟⑴中低溫馴化后的γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于10?16°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；所述的液體種子培養(yǎng)基為:酵母膏 20.0 ?25.0g，蛋白胨 10.0 ?20g，NaCll0.0 ?15.0g, MgSO40.05 ?0.5g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來(lái)水 1.0L，pH 為 6.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0007](3)將液體二級(jí)種子按發(fā)酵液體積的3?9%接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10?16°C培養(yǎng)72?144h時(shí)，S卩海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ-內(nèi)酰胺酶結(jié)束；所述的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:牛肉膏10.0?25.0g，蛋白胨2.0?20.0g，乙酰胺5.0?20g，Tween800.1?
0.4g，(NH4)2SO4L O ?1.5g，KH2PO4L 4 ?2.0g, MgSO40.1 ?0.4g，CaCl20.2 ?0.3g，ZnSO4.7H20 2.4 ?8.0mg，自來(lái)水 1.0L，pH 為 5.0 ?8.0，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌30min ；
[0008](4)將步驟(3)的發(fā)酵液在4000?8000rpm離心收集菌體，超聲破碎，收集到的上清液即為粗酶液；
[0009](5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，還可以將步驟(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
[0010]進(jìn)一步的，步驟(I)中產(chǎn)生Y-內(nèi)酰胺酶菌種的活化培養(yǎng)基為:酵母膏20.0?25.0g，蛋白胨 10.0 ?12.0g, NaCl 10.0 ?15.0g，瓊脂 20.0 ?25.0g,自來(lái)水 1.0L, pH 值為7.4，于103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min。
[0011]本發(fā)明中使用的能產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶的菌種，初期活化和生長(zhǎng)條件按中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)提供的說(shuō)明進(jìn)行。菌株先活化、再經(jīng)過(guò)逐級(jí)低溫馴化后發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶時(shí)按本發(fā)明產(chǎn)酶條件進(jìn)行培養(yǎng)，低溫馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，用10?25vt %甘油制成的菌懸液、在-80°c條件下可以長(zhǎng)期保藏。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0013](I)本發(fā)明生產(chǎn)的低溫γ -內(nèi)酰胺酶經(jīng)過(guò)溫和的熱處理即可使低溫酶的活力喪失，而低溫或適溫處理并不會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)，尤其是在低溫下還具有高酶活力及高催化效率；改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量；
[0014](2)本發(fā)明的方法簡(jiǎn)化了加工工藝，縮短加工時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率并從根本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備的環(huán)節(jié)，省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用，在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；
[0015](3)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的低溫γ -內(nèi)酰胺酶主要應(yīng)用于拆分外消旋體γ -內(nèi)酰胺，獲得光學(xué)純的㈠γ -內(nèi)酰胺，低溫γ -內(nèi)酰胺酶的應(yīng)用可進(jìn)一步提高原料的利用率及轉(zhuǎn)化率，而且該酶制劑在應(yīng)用中操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低，具有更廣闊的工業(yè)開發(fā)價(jià)值與市場(chǎng)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1
[0018](I)培養(yǎng)基制備
[0019]①菌種活化培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g, NaCll0.0g，瓊脂20.0g,自來(lái)水1.0L, pH7.4，于 103kpa，121 °C 高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0020]②菌種低溫馴化培養(yǎng)基:酵母膏0.2g，N-乙酰-L-苯丙氨酸1.0g, NH4Cl 2.0g,Na2HP040.lg, NaH2P040.lg, MgSO40.05g，瓊脂粉 20g，自來(lái)水 1.0L, pH 值為 6.0，于 103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0021]③液體種子培養(yǎng)基:酵母膏20.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g, MgSO40.05g ；ZnSO4.7H202.4mg，自來(lái)水 1.0L, pH6.0，于 103kpa，121 °C高壓蒸汽滅菌 30min ；
[0022]④液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基:牛肉膏l(xiāng)0.0g，蛋白胨2.0g,乙酰胺5.0g, Tween800.lg，(NH4)2SO4L 0g, KH2PO4L 4g，MgSO40.lg, CaCl20.2g，ZnSO4.7H20 2.4mg，自來(lái)水 1.0L, pH 值
5.0，121°C，于 103kpa，121°C 高壓蒸汽滅菌 30min。
[0023](2)將產(chǎn)生γ-內(nèi)酰胺酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌種說(shuō)明進(jìn)行初始活化；
[0024](3)將(2)中活化好的菌種于低溫馴化培養(yǎng)基中逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低，30°C— 25°C— 22°C— 20°C— 18°C— 16°C— 14°C— 12°C— 10°C，馴化 8 天左右，使菌種能在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好，當(dāng)菌種在低溫環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)即馴化結(jié)束；
[0025](4)按常規(guī)方法將步驟(3)中低溫馴化后的γ -內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌在液體種子培養(yǎng)基中于10?12°C培養(yǎng)48?72h后，按5vt%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；
[0026](5)將⑷中制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3?5%的接種量接入5L的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在10?12°C培養(yǎng)120?144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫γ -內(nèi)酰胺酶結(jié)束；
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