與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖系列分子標(biāo)記及獲取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的系列 分子標(biāo)記及其獲取方法。
【背景技術(shù)】
[000引甜瓜（化cumis melo L.)是葫蘆科甜瓜屬一種重要水果型蔬菜作物，國(guó)內(nèi)外栽培 普遍；甜瓜是我國(guó)高端農(nóng)業(yè)的優(yōu)勢(shì)作物，對(duì)農(nóng)民增收與農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整有著重要意義。白粉病 是一種嚴(yán)重危害甜瓜生產(chǎn)的世界性病害，從苗期至收獲期均可發(fā)生。白粉病主要危害甜瓜 的葉片，也侵染葉柄和莖蔓，可導(dǎo)致植株光合能力下降，引起早衰甚至死亡，嚴(yán)重影響甜瓜 的產(chǎn)量和品質(zhì)。近年來，隨著生產(chǎn)的規(guī)?；蜕唐坊潭鹊奶岣?，白粉病迅速蔓延，已成為 國(guó)內(nèi)外甜瓜等瓜類作物綠色生產(chǎn)的主要障礙。
[0003] 引起甜瓜白粉病的病原菌主要有單囊殼白粉菌（Podos地aera xanthii)和二抱白 粉菌（Golovinomyces cichoracearum)，其中W單囊殼白粉菌（P.xanthii)占主導(dǎo)。甜瓜白 粉病菌生理小種多，分化快，僅P. xanthii常見生理小種就多達(dá)7個(gè)，包括0、1、2US、2F、3、 4、5,其中P.xanthii 2F是國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)的優(yōu)勢(shì)生理小種（程鴻，我國(guó)甜瓜白粉病研究進(jìn) 展及生理小種的初步鑒定，長(zhǎng)江蔬菜，2011 (18) : 1-5)，因此開展針對(duì)甜瓜白粉病P. xanthii 2F生理小種的抗病基因研究將是解決甜瓜白粉病的首要突破口。中國(guó)專利申請(qǐng)"與甜瓜 白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異性片段及其獲得方法"（申請(qǐng)?zhí)枺?00710178022. 7) 中，公開了一種與甜瓜白粉病抗性基因PM-2F緊密連鎖的特異片段，其具有序列表中SEQ ID N0:1~4所述的DNA序列；獲得的SSR特異片段具有重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn)定可靠，便 于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)。2008年，張海英等W高抗白粉病菌P.xanthii 2F的日本網(wǎng)紋甜瓜自交系 K7-1與感病哈密瓜自交系K7-2為親本構(gòu)建了包含106個(gè)株系的RILs群體，遺傳分析發(fā)現(xiàn) K7-1對(duì)P. xanthii 2F的抗性由單顯性基因Pm-2F控制，篩選得到了與Pm-2F連鎖的分子 標(biāo)記CMBR8(對(duì)應(yīng)于專利申請(qǐng)200710178022. 7中的SSR509)和CMBR120(對(duì)應(yīng)于專利申請(qǐng) 200710178022. 7中的SSR510)，連鎖距離分別為1cm和3cm(張海英，甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F的遺傳特性及其緊密連鎖的特異片段，園藝學(xué)報(bào)，2008, 35 (12) 1773-1780)。但由于標(biāo) 記連鎖分析所用群體較小、標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)等問題，使得該兩個(gè)標(biāo)記 應(yīng)用于甜瓜抗白粉病輔助育種還有一定的局限性。
[0004] 因此，在目前的科研和實(shí)踐中，開發(fā)與Pm-2F更緊密連鎖的分子標(biāo)記，將有助于應(yīng) 用分子標(biāo)記輔助選育抗白粉病生理小種P. xanthii 2F的甜瓜品種，同時(shí)也為克隆Pm-2F基 因奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的系列標(biāo)記及其獲得方 法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的系列分子標(biāo)記，具有序列表中的SEQ ID NO: 1~8的至少一個(gè)的核巧酸堿基序列。
[000引本發(fā)明的目的是通過W下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的系列分子標(biāo)記的獲取方法，包括如下步 驟：
[0010] 供試材料選取步驟；選取供試材料；
[0011] 甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步驟：
[0012] 對(duì)所述供試材料進(jìn)行苗期抗病接種鑒定，得到抗、感池材料；再利用集團(tuán)混合分析 法，提取所述抗感池材料的基因組DNA，構(gòu)建抗感DNA池；
[0013] 再通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)黃瓜高密度遺傳圖譜中的SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲取與目標(biāo) 性狀連鎖的SSR標(biāo)記；
[0014] 再對(duì)所述與目標(biāo)性狀連鎖的SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳連鎖分析，初步定位目標(biāo)基因 Pm-2F ；
[0015] 與目標(biāo)性狀連鎖的SNP^ndel位點(diǎn)的獲取步驟；
[0016] 在所述Pm-2F基因初步定位區(qū)間設(shè)計(jì)引物，在甜瓜抗感親本與所述抗感DNA池中 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，測(cè)序后再經(jīng)序列比對(duì)獲取所述與目標(biāo)性狀連鎖的SNP^ndel位點(diǎn)；
[0017] 與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取步驟：
[001引針對(duì)所述與目標(biāo)性狀連鎖的SNP^ndel位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)CAI^S^ndel標(biāo)記，在驗(yàn)證材 料中驗(yàn)證所述候選SNP^ndel位點(diǎn)，獲得與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0019] 進(jìn)一步地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步驟中，所述與目標(biāo)性狀連 鎖的SSR標(biāo)記，具有序列表中SEQ ID NO ;9~14的至少一個(gè)的核巧酸堿基序列，其中；
[0020] 序列表中SEQ ID N0:9為引物SSR02733對(duì)抗病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序 列；
[0021] 序列表中SEQ ID NO: 10為引物SSR02733對(duì)感病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序 列；
[0022] 序列表中SEQ ID ^:11為引物55302734對(duì)抗病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序 列；
[0023] 序列表中SEQ ID NO: 12為引物SSR02734對(duì)感病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序 列。
[0024] 序列表中SEQ ID NO: 13為引物CS27對(duì)抗病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0025] 序列表中SEQ ID NO: 14為引物CS27對(duì)感病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列。
[0026] 優(yōu)選地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步驟中，用于PCR擴(kuò)增所述SSR 標(biāo)記的引物的核巧酸堿基序列為：
[0027] SSR 引物 SSR02733 ;
[002引 上游引物序列；5' -TTGTTAGGTAAGCCATGCCC-3'，
[0029] 下游引物序列；5' -TTTGCCTGAGGAAGAATCTGA-3' ；
[0030] SSR 引物 SSR027：M ;
[0031] 上游引物序列；5' -TGTTGTTGGACCCCTTCAAT-3'，
[003引 下游引物序列；5, -TGTCAAAGGAGGAGGTGGAG-3,；
[0033] SSR 引物 CS27;
[0034] 上游引物序列；5, -GCTGAGTTATGGGGAAAGCA-3,，
[00巧]下游引物序列；5' -ATGTTGTTGGACCCCTTCAA-3，。
[0036] 優(yōu)選地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步驟中，用于所述SSR標(biāo)記的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0037] 階段 1 ;94°C預(yù)變性 3min ;階段 2 ;94°C 20s，55°C 20s，72°C 30s，共循環(huán) 30 次；階 段3 ;72°C延伸lOmin ;階段4 ;4°C保持。
[003引進(jìn)一步地，所述與目標(biāo)性狀連鎖的SNP^ndel位點(diǎn)的獲取步驟中，所述PCR擴(kuò)增反 應(yīng)得到的抗病材料和感病材料特異性擴(kuò)增的序列，具有序列表中SEQ ID NO: 15~22中至 少一個(gè)的核巧酸堿基序列，其中：
[0039] 序列表中SEQ ID NO: 15為引物Cum-1對(duì)抗病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0040] 序列表中SEQ ID NO: 16為引物Cum-1對(duì)感病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0041] 序列表中SEQ ID NO: 17為引物Cum-2對(duì)抗病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0042] 序列表中SEQ ID NO: 18為引物Cum-2對(duì)感病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0043] 序列表中SEQ ID NO: 19為引物Mel-1對(duì)抗病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0044] 序列表中SEQ ID NO: 20為引物Mel-1對(duì)感病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0045] 序列表中SEQ ID NO: 21為引物Cum-3對(duì)抗病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列；
[0046] 序列表中SEQ ID NO: 22為引物Cum-3對(duì)感病材料特異性擴(kuò)增的核巧酸堿基序列。
[0047] 優(yōu)選地，所述與目標(biāo)性狀連鎖的SNP^ndel位點(diǎn)的獲取步驟中，用于擴(kuò)增所述抗 病和感病材料特異性擴(kuò)增的序列的引物的核巧酸堿基序列為：
[0048] Cum-1 引物；
[0049] 上游引物序列；5' -GTACAAGAGTTCTGCTGTGAAGGA-3'，
[0050] 下游引物序列；5' -TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3' ；
[0化^ Cum-2引物；
[0化2]上游引物序列；5' -ATCTTCGAACATCATCTTTGAC-3，，
[0053]下游引物序列；5' -ATCCCAAATCTCCAATATCG-3' ；
[0化4] Mel-1 引物；
[00巧]上游引物序列；5' -CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3'，
[0056]下游引物序列；5' -GAAAGATTCATAGGAGAACTCGTCC-3' ；
[0化7] Cum-3 引物；
[0058] 上游引物序列；5' -CACACAGTGGACAACAGTACAT-3，，
[0059] 下游引物序列；5, -AAGATTGATTGACGATTGATTG-3，。
[0060] 進(jìn)一步地，所述與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的系列標(biāo)記的獲取步驟中， 用于PCR擴(kuò)增所述CAI^S標(biāo)記的引物的核巧酸堿基序列為：
[0061] CAI^S 引物 CAPS-Dde I ;
[0062] 上游引物序列；5' -GCCCAACCTTCAACTCGATA-3'，
[0063] 下游引物序列；5' -TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3' ；
[0064] CAPS 引物 CAPS-Hph I ;
[00化]上游引物序列；5, -CAGTAGGGACACACAACC-3,，
[0066] 下游引物序列；5' -TATGCCATACGCTAATGT-3' ；
[0067] 進(jìn)一步地，所述與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取步驟中， 用于所述CAI^S標(biāo)記的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0068] 階段 1 ;94°C預(yù)變性3min ;階段2 ;94°C20s，Tm值20s，72°C30s，共循環(huán)30次；階段 3 ;72°C延伸 lOmin ;階段 4 ;4°C保持；其中 CAPS 標(biāo)記 Tm 值為；CAPS-Dde I ;57°C、CAPS-Hph I ：55°C ；
[0069] 進(jìn)一步地，所述與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取步驟中， 所述標(biāo)記CAPS-Dde I的內(nèi)切酶為Dde I限制性內(nèi)切酶，所述標(biāo)記CAPS-Hph I的內(nèi)切酶為 化h I限制性內(nèi)切酶；
[0070] 所述與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的分子標(biāo)記的獲取步驟中，標(biāo)記 CAPS-Dde I酶切位點(diǎn)為；GCACT，標(biāo)記CAPS-Hph I酶切位點(diǎn)為；GGTGA ;
[0071] 所述與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖的系列標(biāo)記的獲取步驟中，所述酶切反 應(yīng)條件為：
[007引階段1 ;37°C酶切12~16h ;階段2 ;65°C酶變性20min ;階段3 ;4°C保持。
[0073] 進(jìn)一步地，所述與甜瓜抗白粉病基因Pm-