包含POKEMON基因的siRNA的運輸載體顆粒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，特別是涉及一種W己型肝炎病毒核也蛋白作為載 體將P0KEM0N基因的siRNA包裹于其中的制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前研究顯示，哺乳動物己型肝炎病毒的核殼或核也含有由183或185個氨基酸 殘基構成的序列。若干種嗜肝DNA病毒的己型肝炎核也蛋白單體可在受感染細胞中自組裝 成被稱為己型肝炎核也蛋白顆粒（皿C顆粒）的穩(wěn)定聚集體。業(yè)已報導了皿C顆粒的兩種 H維結構。第一種結構包括含有二聚體形式的90個拷貝的皿C亞基蛋白或180個獨立單 體蛋白的小群體，第二種結構包括含有二聚體形式的120個拷貝的皿C亞基蛋白或240個 獨立單體蛋白的大群體。該些顆粒分別被稱為T = 3或T = 4顆粒，其中"T"為H角劃分 數。該些人感染性病毒的皿C顆粒的直徑分別為大約30或34nm。
[0003] P0KEM0N是P0K轉錄抑制因子家族成員之一，它包括一個氨基末端P0Z/BTB結構域 和駿基端Kr化pel型鋒手指結構域，是T淋己細胞、B淋己細胞和紅細胞系發(fā)育和成熟的重 要因子。P0KEM0N基因在乳腺癌、肝癌和淋己瘤等腫瘤的異常表達在癌基因轉化和腫瘤的發(fā) 生過程中發(fā)揮重要的作用。P0KEM0N是一種新發(fā)現的致癌基因，它能夠導致其它致癌基因發(fā) 作，最終促使腫瘤形成。P0KEM0N可W使癌細胞獲得抗老化和死亡的能力，因此被稱為癌癥 的"總開關"。重點是細胞內P0KEM0N基因的缺失不會對細胞的正常生長造成影響，該為設 計低副作用的特異性抗癌藥物提供了可能。
[0004] RNA干擾技術被形象地稱為基因敲低（knock-down)或基因沉默 (gene silencing)，是一種典型的轉錄后基因調控方法，又稱轉錄后基因沉默 (post-transcriptional genesilencing, PTGS)，是一種快速、高效的抑制特異性基因表達 的方法，其最關鍵的效應分子就是具有21-2化t堿基的短片段雙鏈RNA分子，稱之為SiRNA， 能夠W序列特異性地結合祀mRNA并使mRNA降解。由于RNA干擾具有高效、特異性，SiRNA 介導的轉錄后基因沉默是針對祀向基因的外顯子序列，對其啟動子或內含子序列卻沒有效 應，是一種轉錄后基因表達調控機制，且不誘導非特異性的干擾素激活途徑，因而成為繼反 義核巧酸、核酶技術之后一種新的分析功能缺失表型的工具，為基因功能研究和基因治療 開辟了新的道路，目前已廣泛用于抑制特定基因的表達研究，特別是祀向惡性腫瘤中高度 表達基因的研究。使用SiRNA的基因治療的關鍵在于W最小的副作用和最高的給藥效率將 SiRNA傳遞到期望組織。然而，SiRNA具有低的細胞透性，并且因在生理環(huán)境下等對基因的 降解酶敏感而不能維持必要的濃度，從而易于分解，無法達到理想效果，導致SiRNA作為藥 物使用受到限制。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了克服上述問題，基因的載體變得尤為重要，本發(fā)明擬在研究一種可將SiRNA 包裹于其中，能有效地循環(huán)而不被活體中的免疫細胞移除或排出，保護SiRNA不被活體細 胞中的酶分解的運輸載體。并且不會改變或降低siRNA抑制POKEMON基因表達的作用。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供4對針對人POKEMON基因的SiRNA序列，能抑制人POKEMON 基因表達的SiRNA用于腫瘤基因治療，來抑制腫瘤細胞的生長。
[0007] 本發(fā)明首先提供了一種降低POKEMON基因表達的小分子干擾RNA (SiRNA)，包括正 義鏈和反義鏈，序列如下：
[0008] siRNAl 正義鏈；5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3，
[000引 反義鏈；3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5,
[0010] siRNA2 正義鏈；5' -GACCUUAAAUGAUUUCUGUUU-3'
[0011] 反義鏈；3 ' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5 '
[001引 siRNA3 正義鏈；5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3'
[0013] 反義鏈；3, -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5，
[0014] siRNA4 正義鏈；5, -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3，
[001 引 反義鏈；3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5,
[0016] 本發(fā)明所述小分子干擾RNA(siRNA)針對的POKEMON基因的祀序列如SEQ ID No. 1-4 所示。
[0017] 沈Q ID No. 1 ;AA CCCACCACAAACGTAGAAT CC
[0018] 沈Q ID No. 2 ;AA GACCTTAAATGATTTCTGT CT
[0019] 沈Q ID No. 3 ;TT CTGACGTGAAGAGGTCTTA GC
[0020] 沈Q ID No. 4 ;TT CTCTGTGACACACACATCT TC
[0021] 本發(fā)明提供了一種小分子干擾核糖核酸（SiRNA),其包含正義RNA片段和反義RNA 片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制人POKEMON 基因的表達。對于上述小分子干擾核糖核酸來說，所述正義RNA片段和反義RNA片段可W 存在于兩條不同的RNA鏈上，也可W存在于同一條RNA鏈上。當正義RNA片段和反義RNA 片段存在于同一條RNA鏈上時，所述核糖核酸優(yōu)選為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片 段和反義RNA片段之間的互補區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。對于上述任一項所述的小分子干擾 核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為21個核巧酸。對于任一項所述的小 分子干擾核糖核酸，其中雙鏈RNA的互補區(qū)域至少有19個堿基對。
[0022] 本發(fā)明進一步提供一種可將POKEMON基因的SiRNA包裹于其中的運輸載體，其中， 所述運輸載體是己肝病毒的核也蛋白皿C。所述納米顆粒的平均粒徑為30-34nm。
[0023] 所述的SiRNA運輸載體不會改變或降低SiRNA抑制POKEMON基因表達的作用。其 中，所述的SiRNA的運輸載體在基因沉默中的用途。所述的SiRNA輸送載體在制備癌癥基 因治療藥物中的應用。
[0024] 本發(fā)明提供的SiRNA能特異性抑制POKEMON基因的表達，MIT分析實驗結果表明 本SiRNA能抑制癌細胞的增殖。該SiRNA能夠高效、特異地抑制人POKEMON基因的表達，同 時具有較低的毒副作用。
【具體實施方式】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合表格對本發(fā)明作進 一步的詳細描述。
[0026] 實施例1抑制人POKEMON基因表達的siRNA序列的合成
[0027] 從 Genebank 調取 POKEMON基因（NM_015898)信息，用 http://sirna. wi. mit. edu/ home, php的在線設計軟件設計針對POKEMON基因可能有效的SiRNA祀點。再通過BLAST分 析，將候選SiRNA祀位點同人類基因序列進行同源性比對，排除同POKEMON基因W外的其它 人類基因序列具有較高序列同源性（16個W上堿基）的序列，W確保候選SiRNA祀位點不 會對其它人類基因發(fā)生抑制作用，而僅對POKEMON基因具有特異的抑制作用。分析設計總 共得到20對SiRNA。
[0028] 實施例2RT-PCR法檢測SiRNA對POKEMON基因的沉默效率
[0029] 使用Invitrogen的lipofectamine2000脂質體進行轉染，所有操作均嚴格遵 守Invitrogen提供的操作規(guī)程。將處于對數生長期的化pG2細胞進行膜酶消化，制成細 胞息液（細胞數約為5X lOYml)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度達到約40%即可用 于轉染。將SiRNA干粉溶解于無RNA酶的無菌水中，配置終濃度為20pmol/L的SiRNA溶 液。轉染時，分別取10 y L的上述一種SiRNA溶液和5 y L的lipofectamine2000分別稀釋 于250 y L無血清培養(yǎng)液（Opti-MEM)中，并在室溫下賠育5min，然后將上述SiRNA溶液和 lipofectamine2000溶液混合，復合物與室溫下靜置20min后，把500