一組特異識別大田軟海綿酸的核酸適配體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全生物技術領域，設及對腹瀉性貝類毒素大田軟海綿酸具有高 親和性和高特異性的識別元件一-單鏈DNA核酸適配體的序列。
【背景技術】
[0002] 大田軟海綿酸（Okadaic acid, OA)是一種小分子脂溶性毒素，是由罐藻屬和原甲 藻屬藻類產(chǎn)生的一種次生代謝產(chǎn)物。貽貝、扇貝、牡頗等貝類生物濾食該些有毒藻類后使大 田軟海綿酸在其體內積累。當人誤食了該些貝類后，就可能引起中毒，癥狀為腹瀉、惡屯、、 嘔吐、腹痛等。由于其主要中毒癥狀為腹瀉，所W將其稱為腹瀉性貝類毒素值iarrhetic 化ellfish化isoning，DSP)。腹瀉性貝類毒素還有罐藻毒素值inophysistoxin，DTX)、始 毒素（Pectenotoxin，PT幻、扇貝毒素（Yessotoxin，YT幻等。0A雖然是一種非致命毒素，沒 有很強烈的毒性，但分布廣泛，熱穩(wěn)定性好，在平常的烹任過程中不能通過高溫加熱破壞其 化學結構和降低其毒性，因此中毒事件時有發(fā)生。0A引起中毒的機制是，0A可特異性抑制 蛋白磯酸酶PP1和PP2A的活性，導致大量蛋白質的過磯酸化和積累，改變信號傳導途徑，破 壞細胞生物機能，導致細胞調亡。另外，研究發(fā)現(xiàn)0A還是腫瘤促進因子。
[0003] 目前，檢測大田軟海綿酸的方法主要有：小鼠生物分析法（MBA)、高效液相色譜 法（HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附法巧LISA)、表面等離子共振法（SPR)、蛋白磯酸酶抑制分析法 (PPIA)等。MBA根據(jù)注射毒素后小鼠的存活時間和中毒癥狀來評價毒性，結果較為直觀，是 很多國家檢測貝類毒素的標準方法；但該方法受小鼠品系和個體差異的影響較大，重復性 差，小鼠購買和飼養(yǎng)費用也較高，且無法確定毒素的具體成分和含量。HPLC和SPR靈敏度 高、檢出限低，并可實現(xiàn)連續(xù)自動檢測；但樣品前處理要求高，需要昂貴的儀器設備和專業(yè) 的技術人員，不適合現(xiàn)場快速檢測。ELISA等依賴抗原-抗體結合反應的檢測方法操作簡 便，特異性強，靈敏度高，無需昂貴的儀器設備，適用于現(xiàn)場快速檢測；然而，制備抗體的過 程繁瑣耗時，成本昂貴，且0A的相對分子量僅為804. 5,無免疫原性，需要偶聯(lián)大分子載體 后才可用于制備抗體，另外，不同批次抗體的重復性和穩(wěn)定性不如核酸適配體，儲存條件也 較為嚴苛。PPIA檢測受0A特異性抑制的蛋白磯酸酶的活性，所W特異性較好，檢測時間較 短，但會受到樣品和環(huán)境的干擾。
[0004] 核酸適配體（Aptamer)是近年來新興的一種祀標識別分子，它是一條長度為 40-100nt的單鏈寡核巧酸，可形成發(fā)卡、假結、凸環(huán)、G-四聯(lián)體等空間構象，通過空間結構 的匹配、氨鍵作用、靜電作用等與祀標穩(wěn)定結合。適配體與祀標結合的親和性和特異性可與 抗體相媳美，同時與抗體相比還具有很多優(yōu)勢；（1)篩選得到的適配體序列可由生物公司 合成，既不依賴動物體內免疫，也可減少不同生產(chǎn)批次間的差異；（2)適配體的祀標種類極 其廣泛，小到氨基酸、核巧酸、金屬離子、毒素、有機染料、抗生素、輔因子等小分子物質，大 到酶、生長因子、抗體、核酸等生物大分子，甚至完整的病毒、細菌和細胞等都可作為適配 體篩選的祀標；（3)篩選適配體的配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELE)〇是一種體外篩選技術，不設及任何動物和細 胞，毒素和沒有免疫原性的小分子也可篩選到高親和力的適配體；(4)核酸適配體穩(wěn)定性 好，可長期保存并可常溫運輸，也更易于標記或化學修飾。
[0005] 目前，對于小分子物質的適配體主要是通過把祀標固定在酶標板、磁珠或親和層 析柱上進行SELEX篩選。該種固定法可能由于空間排阻效應使小分子喪失部分適配體識別 的位點，有些小分子還需要連接合適的基團或分子進行固定，改變了天然構象，可能影響篩 選到的適配體的應用。毛細管電泳的應用使SELEX篩選非固定小分子的適配體成為可能， 然而該需要昂貴的毛細管電泳設備和姻熟的操作技術和經(jīng)驗。本發(fā)明W水產(chǎn)品中常見的腹 瀉性貝類毒素OA為祀標，利用氧化石墨締（Graphene Oxide,GO)輔助分離的非固定SELEX 技術佑0-SELE幻篩選得到了對0A具有高親和性和特異性的單鏈DM核酸適配體。該適配 體可用于快速、靈敏、特異地檢測水產(chǎn)品中的0A，也可為臨床上0A中毒的診斷和治療提供 新的途徑。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種能特異性識別大田軟海綿酸、且具有高親和性的核酸適 配體序列，W克服現(xiàn)有的檢測大田軟海綿酸技術的不足，特別是免疫檢測法中，抗體制備必 須依賴動物或細胞，過程繁瑣耗時，成本昂貴，不同批次抗體間的重復性和穩(wěn)定性欠佳，儲 存條件也較為嚴苛等缺陷，為開發(fā)新型的大田軟海綿酸分析檢測方法奠定基礎。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用氧化石墨締輔助分離的SELEX技術，利用氧化石墨 締通過JT-JT作用非特異性吸附單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)的特性，在SELEX 的分離步驟中，用氧化石墨締吸附未與大田軟海綿酸結合的游離ssDNA，使其與大田軟海綿 酸-ssDNA復合物分離，通過多輪篩選的系統(tǒng)進化，獲得特異性高、親和力強的大田軟海綿 酸核酸適配體，其序列為：
[0008] 0A-27 ;5' -CAGCTCAGAA GCTTGATCCT ATTTAGCCAT GCTGAGGGAGATGCGCAGTC ACTACCACCT GACTCGAAGT CGTGCATCTG-3>
[0009] 0A27-1 ;5' -ATTTAGCCAT GCTGAGGGAG ATGCGCAGTC ACTACCACCT-3，
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0011] 1)與抗體相比，適配體可人工合成，不依賴動物和細胞，周期短、成本低、批次間的 差異小，便于化學修飾，穩(wěn)定性也好，可長期保存。
[0012] 2)篩選小分子物質的核酸適配體，傳統(tǒng)的方法是將小分子祀標固定在磁珠、酶標 板、親和層析柱等固相表面，固相表面的空間排阻效應可能使祀標喪失部分適配體的識別 位點，有些小分子物質需要通過連接分子偶聯(lián)到固相表面，該就改變了其天然構象，該些都 可能影響適配體在實際檢測中對小分子的識別效果。本發(fā)明采用氧化石墨締輔助分離的 SELEX技術，無需固定小分子毒素，可篩選到針對天然狀態(tài)毒素分子的適配體。
【附圖說明】
[001引圖1是不同用量氧化石墨締吸附ssDM的試驗結果
[0014] 圖2是篩選大田軟海綿酸核酸適配體的SELEX技術的流程圖
[0015] 圖3是適配體序列的二級結構圖，A為0A-27, B為0A27-1
[0016] 圖4是適配體的飽和結合曲線圖，A為0A-27, B為0A27-1
[0017] 圖5是適配體的特異性試驗結果，A為OA-27, B為OA27-1
[0018] 表1沈LEX篩序過程中每一輪的篩選條件
[0019] 表2挑選出的8條ssDNA序列的解離常數(shù)Kd值
【具體實施方式】
[0020] 1、隨機ssDNA文庫和引物的合成
[0021] 構建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，由兩端各20nt的引物區(qū)和中間40nt的隨 機區(qū)組成，序列為；5' -CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-N4ctGACTCGAAGTCGTGCATCTG-3'（N4。代表 40 個隨機核巧酸），由美國Integrated DNA Technologies公司合成。
[002引 上游引物；5 ' -CA