5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶的環(huán)式重排變體和互補(bǔ)片段對(duì)的制作方法
【專利說明】5-婦醇式丙鋼醜-莽草酸-3-磯酸合酶的環(huán)式重排變體和 互補(bǔ)片段對(duì) 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的環(huán)式重排變體和互補(bǔ)片段 對(duì)，及生成和使用它們的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶（EPSPS)是真菌、細(xì)菌、藻類、高等植物及 寄生于脊椎動(dòng)物上的寄生蟲頂覆蟲體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑（即莽草酸合成途徑）中一 個(gè)關(guān)鍵酶，它催化一分子的莽草酸-3-磯酸（S3P)和磯酸帰醇式丙麗酸（陽(yáng)P)生成5-帰醇 式丙麗酸莽草酸-3-磯酸（EPSP)。莽草酸合成途徑產(chǎn)物除參與芳香族氨基酸如苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸等的合成W外，還參與植物體內(nèi)一些生物堿、香豆素、類黃麗、木質(zhì)素、剛巧 衍生物、酷類物質(zhì)等的次生代謝，形成的植物組分占植物干重的大約35%甚至更多。
[0004] 草甘麟，即N-麟醜甲基甘氨酸，是一種廣譜、高效的發(fā)芽后除草劑。草巧麟一經(jīng)施 用后能被植物迅速吸收，并隨其同化產(chǎn)物傳導(dǎo)至整個(gè)植株，阻斷EPSP的合成和運(yùn)輸，它是 EPSPS合成底物PEP的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可阻斷陽(yáng)P和S3P該兩種底物在EPSPS的催化下向 EPSP的轉(zhuǎn)化，從而阻斷芳香族氨基酸的生物合成，因此對(duì)植物細(xì)胞分裂、葉綠素合成、蒸騰、 呼吸W及蛋白質(zhì)等代謝過程產(chǎn)生影響而導(dǎo)致植物死亡。
[0005] 環(huán)式重排（circular permutation, CP)是一種重要的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化分析的手 段。蛋白質(zhì)的環(huán)式重排是將蛋白質(zhì)的一級(jí)序列進(jìn)行重排，比如說在將一個(gè)特定位點(diǎn)的N端 移動(dòng)到該個(gè)特定位點(diǎn)C端的C端，即使得原來該點(diǎn)的C端成為了新的蛋白質(zhì)變異體的N端， 該點(diǎn)的原來的N端成為新蛋白變異體的C端。一般來說新的N端和C端之間要加一個(gè)柔初 性較好的接頭，促進(jìn)新蛋白質(zhì)的折疊。簡(jiǎn)單來說相當(dāng)于用一個(gè)接頭將蛋白質(zhì)原來的N端和 C端相連，然后在蛋白質(zhì)的內(nèi)部某一個(gè)位點(diǎn)"剪開"，產(chǎn)生新的N端和C端巧日?qǐng)D1所示)。
[0006] 在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些蛋白質(zhì)環(huán)式重排變異體，產(chǎn)生機(jī)制一般有兩種類型， 分別是復(fù)制/刪除機(jī)制W及分裂融合機(jī)制。對(duì)于前者來說，一個(gè)基因發(fā)生了水平串聯(lián)復(fù)制， 然后在N端和C端發(fā)生了任意剪切，造成了環(huán)式重排變異體的形成。對(duì)于后者來說，一個(gè)已 有的蛋白的分裂產(chǎn)生了兩個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域或者蛋白質(zhì)的片段，它們直接的重新融合產(chǎn)生了新 的環(huán)式重排變異體。該些新的蛋白質(zhì)重排變異體大多數(shù)依舊可W折疊成與天然蛋白質(zhì)類似 的H維結(jié)構(gòu)，所W依舊擁有與天然蛋白質(zhì)類似的功能。當(dāng)然該些變異體一般情況下活力不 如原來的母體，個(gè)別可能擁有更高的活力，但是該些變異體經(jīng)常會(huì)擁有一些特殊功能，比女口 說對(duì)蛋白酶裂解的敏感性降低、識(shí)別更廣譜的底物或者配體、更高的熱穩(wěn)定性，所W近年來 環(huán)式重排作為一種改造蛋白質(zhì)特性的手段得到了研究人員越來越多的關(guān)注。
[0007] 蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)，1957年化chards發(fā)現(xiàn)，用蛋白酶裂解核糖核酸酶A后得到兩個(gè) 只有很少酶活性的膚鏈一S蛋白和S膚鏈，將兩者混合在一起可W恢復(fù)其核糖核酸酶的活 性，該被稱之為蛋白重建（protein reconst;Uution)。后來，人們又發(fā)現(xiàn)許多蛋白可W由其 兩個(gè)或兩個(gè)W上的片斷成功重建，該些片斷既可W由蛋白酶消化產(chǎn)生，也可W通過基因表 達(dá)的方法生成，例如葡萄球菌的核酸酶、色氨酸抑制子等。該些可W拆分的蛋白無論大小都 可能包含一個(gè)W上的能成功使蛋白重建的分拆位點(diǎn)，如氨醜tRNA合成酶有939個(gè)氨基酸， 含有至少八個(gè)該樣的分拆位點(diǎn)。
[0008] 用于蛋白重建的片段通常包括整個(gè)結(jié)構(gòu)單元或者超二級(jí)結(jié)構(gòu)域。蛋白能夠重建表 明該蛋白至少可W在兩個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的片段區(qū)域中的共價(jià)鍵斷開后仍舊保持一定的片 段穩(wěn)定性，而蛋白內(nèi)的非共價(jià)作用則十分特殊，從而使片段有利于向天然的結(jié)構(gòu)靠塊，卻不 形成其它的異變結(jié)構(gòu)。在生物進(jìn)化過程中，該類蛋白中使其形成天然結(jié)構(gòu)的非共價(jià)作用被 極大的優(yōu)化，從而利于形成天然的結(jié)構(gòu)元件或亞結(jié)構(gòu)域。因此無論是一個(gè)完整的膚鏈還是 兩條膚鏈，兩個(gè)沒有共價(jià)鍵相連的亞結(jié)構(gòu)域可W自發(fā)的形成天然的蛋白結(jié)構(gòu)。
[0009] 蛋白質(zhì)的片段互補(bǔ)已經(jīng)被用作研究結(jié)構(gòu)域排列的工具，也被用作研究早期折疊中 間態(tài)的模型。結(jié)合定點(diǎn)突變的蛋白重建可W用來評(píng)價(jià)單個(gè)氨基酸側(cè)鏈對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影 響，結(jié)合瞻菌體展示可W確定兩個(gè)片段之間起主要相互作用的位點(diǎn)。重建的蛋白并非一旦 結(jié)合就永不分開，其片段在形成復(fù)合體和解離成單獨(dú)的片段之間形成動(dòng)態(tài)平衡，該種平衡 的偏移方向取決于片段之間作用力的強(qiáng)弱。
[0010] 最新的研究表明，大腸桿菌的EPSPS也可W由片段天然互補(bǔ)重建其酶活性。把其 基因在218/219氨基酸位點(diǎn)分拆為兩段后，編碼出的兩個(gè)片段在aroA缺陷的大腸桿菌菌株 體內(nèi)可W互補(bǔ)其EPSPS活性；將該兩個(gè)片段分別表達(dá)，其單體大多W包含體形式存在，把純 化的包含體共復(fù)性，就可W互補(bǔ)重建EPSPS活性。說明大腸桿菌的EPSPS無論在體內(nèi)還是 體外，均能通過片段互補(bǔ)重建其活性。
[0011] 片段互補(bǔ)可W有效的解決抗草甘麟EPSPS轉(zhuǎn)基因植物擴(kuò)散的問題，比如將EPSPS 的N端編碼基因加上葉綠體定位膚編碼基因在植物細(xì)胞核染色體中表達(dá)，而將C端編碼基 因在葉綠體中表達(dá)。單獨(dú)一個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)生的片段都不具有EPSPS的活性，因此即使擴(kuò)散 到了外界環(huán)境，也沒有選擇優(yōu)勢(shì)。而當(dāng)N端片段表達(dá)出后，在定位膚的作用下被運(yùn)輸?shù)饺~綠 體，和C端片段互補(bǔ)重組EPSPS活性。如果片段互補(bǔ)的EPSPS突變后具有較高的草巧麟耐 受性，把其分別轉(zhuǎn)入植物的染色體基因組和葉綠體基因組，植物就可W獲得草巧麟耐受性。
[0012] 但是問題在于，許多結(jié)構(gòu)剛性比較強(qiáng)的蛋白很難找到能夠直接發(fā)生天然互補(bǔ)的位 點(diǎn)，或者說即使可W發(fā)生天然互補(bǔ)，效率也比較差。一個(gè)潛在的解決方案在于將兩個(gè)片段分 別與可W發(fā)生相互作用的兩個(gè)蛋白質(zhì)或者可W發(fā)生二聚化的結(jié)構(gòu)域融合，通過蛋白質(zhì)的相 互作用或者結(jié)構(gòu)域二聚化使得兩個(gè)天然無法互補(bǔ)的片段在空間上接近，提高它們相互作用 時(shí)的濃度，該樣就很有可能將幫助兩個(gè)片段進(jìn)行互補(bǔ)。但是同樣的基于該種方法的位點(diǎn)也 不是隨機(jī)選取的，而且前人的研究成功的實(shí)例或多或少都帶有一定的經(jīng)驗(yàn)成分，所W建立 一種確定該位點(diǎn)的有效方法很重要。我們實(shí)驗(yàn)中建立了將環(huán)式重排的位點(diǎn)作為輔助獲得蛋 白質(zhì)片段互補(bǔ)的位點(diǎn)的體系。因?yàn)榄h(huán)式重排本質(zhì)上是利用的短的接頭，將蛋白質(zhì)兩個(gè)片段 直接連在一起，使其在空間上靠近，折疊成天然的活性蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)相互作用輔助的片 段互補(bǔ)技術(shù)是通過蛋白質(zhì)的相互作用將兩個(gè)不能天然互補(bǔ)的片段在空間上拉近，使其恢復(fù) 天然蛋白質(zhì)的活力，因此兩者之間有內(nèi)在的聯(lián)系，我們認(rèn)為環(huán)式重排的研究是很好的蛋白 質(zhì)片段互補(bǔ)系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)。
[001引發(fā)明概述
[0014] 一方面，本發(fā)明涉及5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的環(huán)式重排變異體， 其從N端到C端W B-L-A表示，其中L代表接頭，A代表5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸 合酶全長(zhǎng)氨基酸序列N端至第P位的氨基酸區(qū)段，B代表5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯 酸合酶全長(zhǎng)氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸區(qū)段。在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述5-帰 醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶為大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶如序列1所 示。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，P 選自 71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、 300、328、342、358、359、360、361、362、363 和 364。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，口選自110、145、 215、229、300、328和362。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯 酸合酶不是序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的情況下，P為 與序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶第71、82、110、136、145、 160、185、215、229、234、240、268、300、328、：342、358、359、360、361、362、363 或 364 位對(duì)應(yīng) 的位置。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，P為與序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草 酸-3-磯酸合酶第110、145、215、229、300、328或362位對(duì)應(yīng)的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中， L 為（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 接頭。
[0015] 另一方面，本發(fā)明涉及5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的互補(bǔ)片段對(duì)，其 中第一片段從N端到C端W E-L1-A表示，第二片段從N端到C端W F-L2-B表示，其中E 和F代表相同或不同的二聚化膚，L1和L2代表相同或不同的接頭，A代表5-帰醇式丙麗 醜-莽草酸-3-磯酸合酶全長(zhǎng)氨基酸序列N端至第P位的氨基酸區(qū)段，B代表5-帰醇式丙 麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶全長(zhǎng)氨基酸序列第P+1位至C端的氨基酸區(qū)段，其中當(dāng)E和F相 同時(shí)發(fā)生同二聚化，或者當(dāng)E和F不同時(shí)發(fā)生異二聚化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述5-帰醇 式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶為大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶。在 進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶如序列1所示。 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，P 選自 71、82、110、136、145、160、185、215、229、234、240、268、300、 328、342、358、359、360、361、362、363 和 364。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，口選自110、145、215、 229、300、328和362。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合 酶不是序列1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶的情況下，P為與序列 1所示大腸桿菌5-帰醇式丙麗醜-莽草酸-3-磯酸合酶第71、82、110、136、145、160、185、 215、229、2：34、240、268、300、328、342、358、359、360、361、362、363 或 364 位對(duì)應(yīng)的位置