南方根結(jié)線蟲乙酰膽堿酯酶基因Miace1、Miace2和Miace3、相關蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物基因工程技術領域，具體涉及南方根結(jié)線蟲效應基因i/ZaceA i/Zace巧P i/Zace義相關蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 根結(jié)線蟲是一類非常重要的植物寄生線蟲，廣泛分布于世界各地，能侵染超過 3000種不同植物。根結(jié)線蟲每年造成大概770億美元的經(jīng)濟損失，隨著作物復種指數(shù)的提 高和設施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，根結(jié)線蟲的發(fā)生和危害將會不斷的加劇。由于根結(jié)線蟲的根內(nèi)寄生、 寄主范圍廣泛的特性W及抗根結(jié)線蟲種質(zhì)資源的缺乏限制了化學防治、輪作和抗病育種等 防治方法在控制根結(jié)線蟲危害中的應用。因此，尋找其他有效的防治根結(jié)線蟲的方法是植 物生產(chǎn)所長期面臨的艱巨任務。
[0003] RNA干擾技術（RNAi)的出現(xiàn)使得開發(fā)更為有效的防治根結(jié)線蟲的方法成為可能。 RNAi能通過祀向抑制根結(jié)線蟲特定基因功能而限制根結(jié)線蟲侵染、寄生和繁殖因而能高效 地減少根結(jié)線蟲的危害而且對其他非祀標生物較為安全。RNAi現(xiàn)象最早在秀麗小桿線蟲中 發(fā)現(xiàn)，隨后在植物、無脊椎動物和脊椎動物中都相繼發(fā)現(xiàn)了該種現(xiàn)象。RNAi技術通過dsRNA 特異性的降解祀mRNA，影響或抑制該目的基因功能，從而影響該種生物的生長、發(fā)育、繁殖 甚至能殺死該種生物。該技術相比其他防治方法的最大優(yōu)點是能定向作用于特定的某種 (某類）害蟲而不會影響在該生境中的其他生物。
[0004] 應用病毒載體誘導的基因沉默（VIGS)技術相對于傳統(tǒng)的使用組織培養(yǎng)方法獲得 RNAi轉(zhuǎn)基因植株更加簡單快速，使得我們并不需要通過復雜的組培方法就可快速獲得抗線 蟲植株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供新的南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因ifeceA ifece巧口 Miace3。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供上述南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因的相關蛋白 MI-ACE3。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供上述南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因必iaceA必iace之 和#iace滿勺應用。
[0008] 本發(fā)明通過W下技術方案實現(xiàn)上述目的： 南方根結(jié)線蟲（化?扣J?成§網(wǎng)6 incc供?別a)己醜膽堿醋酶基因必iaceA i/Zace巧口 必iace義H種己醜膽堿醋酶基因的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1-3所示；南方根結(jié)線蟲己醜 膽堿醋酶蛋白MIACE1、MIACE2和MIACE3，H種己醜膽堿醋酶基因氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6 所示。
[0009] 在0. 1XSSC、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交洗膜后，上述南方根結(jié)線蟲己醜 膽堿醋酶基因必iaceA i/Zace巧日必iace為^交且編碼與南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶相關蛋 白的DNA分子，或者將上述南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因ifeceA ifece巧P ifece滿勺 90% W上同源性且編碼根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶相關蛋白的DM分子，也在本發(fā)明的保護范 圍之內(nèi)。
[0010] 所述南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶蛋白MIACE1、MIACE2和MIACE3中的氨基酸序列 氨基酸序列經(jīng)過一個或一個W上氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加并且與南方根結(jié) 線蟲己醜膽堿醋酶相關的衍生蛋白。
[0011] 所述南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因必iaceA i/Zace巧日必iace滿勺重組表達載體 由出發(fā)載體的多克隆位點插入，或由該基因的部分外顯子片段如SEQ ID N0:l-3任一所示 序列構(gòu)建而成。
[0012] 快速制備轉(zhuǎn)基因抗病植物，其表達載體優(yōu)選為IR-X-RI，該載體是一種植物RNAi 病毒載體，其制備方法為將含有南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因胞'aceAi&ace巧日必iaceJ 的RNAi載體導入植物，可W在植物中產(chǎn)生基因的dsRNA，當根結(jié)線蟲侵染該植株后，dsRNA 進入根結(jié)線蟲的體內(nèi)，使基因的mRNA降解，引發(fā)所述基因的失活，嚴重的減弱了線蟲的寄 生能力，從而抑制線蟲的侵染、寄生、繁殖和傳播。
[0013] 上述南方根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因ifeceA ifece巧日ifeceJ在制備轉(zhuǎn)基因植 物的應用中，轉(zhuǎn)基因植物的目的植物優(yōu)選為雙子葉植物或單子葉植物，尤其是煙草和番茄。
[0014] 上述轉(zhuǎn)基因抗病植物的重組基因表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌，含有所述南方 根結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因胞aceAi/Zace巧P
[0015] 作為上述應用的一個方面，抗根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植物獲得方法為；將含有南方根 結(jié)線蟲己醜膽堿醋酶基因必iaceA i/Zace巧日必iace滿勺重組表達載體利用農(nóng)桿菌導入目的 植物中，或者通過使用Ti質(zhì)粒、化質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導入或 基因槍等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株，得到抗 根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植物。
[0016] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明提供了一種新的有利于提高植物抗根結(jié)線蟲活性的基因序列及其編碼蛋白，為 進一步培育有廣譜抗植物寄生線蟲的植物新品種奠定基礎。
【附圖說明】
[0017] 圖1為擴增ifece堪因的電泳結(jié)果，其中M為分子量標記； 圖2為南方根結(jié)線蟲不同發(fā)育時期必iaceAi/Zace巧日必iace堪因的相對表達量； 圖3為比-60 BS載體示意圖； 圖4為IR-ACE-RI載體示意圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過實施例進一步解釋本發(fā)明，但對本發(fā)明不做任何形式的限定。實施例中 無特殊說明，均為本領域常規(guī)實驗方法；所用實驗材料如無特殊說明，均購自常規(guī)生化試劑 商店。實施例中定量實驗均設置H次重復，結(jié)果取平均值。
[0019] 生物材料來源如下： 南方根結(jié)線蟲：自行采集，參考文獻出uM，X.，Zhuo，K.，Liao, J，L. Multiplex PCR for the simultaneous identification and detection of iccogcjYs, M. enterolobii and M. javanica using DNA extracted directly from individual galls. Phytopathology, 2011， 101(11): 1270-1277。
[0020] W下生物材料為發(fā)明人獲贈得到： 本氏煙； 載體比-60 BS 和 IR-X-RI;參考文獻：化val P.，化ta M. K.，Riad A.，et al. A universal expression/silencing vector in plants. Plant Physiology, 2007, 145, 1251 - 1263。
[0021] W上生物材料公眾可W從申請人處獲得。
[0022] 實施例1南方根結(jié)線蟲i/ZaceJ蛋白及其編碼基因的克隆 (1)使用TRIZ化法提取南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲RNA，然后使用Clontech RACE試劑盒 將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0023] (2)本實驗室利用源于南方根結(jié)線蟲基因組數(shù)據(jù)庫中的MiVlctgl711序列 ( http://www6.inra.fr/meloidogyne_incognita/Genomic-resources)， W 及 GenBank 敬祗耗啼游 Caenorhabditis elegans 喊A，Burs 邵helenchus xylophilus (GU166347.1),化encA"占沁占巧巧83057.1), Zoa 7(9<3 (XM_003144938.1), 設計引物獲取ifece滿勺3' RACE片段。3' RACE片段的獲得：使用引物對，MIE31F ; TTCACAATGGAATTCTTCAATCAGG，（SEQ ID N0:7)和 Clontech RACE 試劑盒的銷定引物 NUP, W步驟（2)獲得的cDNA為模板進行擴增。PCR擴增體系；cDNA 2uL，兩條引物各3uL， 10XK孤 plus Buffer 5]iL，M拆〇4 2]iL，dNTP SyL, K孤 plus