一種基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型指導胞內(nèi)還原力調(diào)節(jié)的異丁醇合成菌株構建方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于合成生物學和生物能源技術領域，具體設及初始異了醇合成菌株構 建，并通過基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型模擬預測還原代謝調(diào)節(jié)關鍵祀點，指導構建異源依賴 于NADP的甘油-3-磯酸脫氨酶基因（gapN)，并通過不同強度的組成型啟動子控制gapN的 表達水平調(diào)節(jié)胞內(nèi)還原力，構建異了醇合成菌株的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著生物能源的興起，異了醇的生物合成最近獲得了重要的關注。異了醇具有能 量密度高，揮發(fā)性和腐蝕性小，辛燒值高等優(yōu)點，是理想的汽油替代品，也是最基本的化學 平臺物質之一。目前采用合成生物學構建異源化hlich途徑，W a-酬異戊酸為前體，禪合 分支氨基酸合成途徑，在大腸桿菌、枯草芽抱桿菌和谷氨酸椿狀桿菌等菌種中實現(xiàn)了異了 醇的合成。
[0003] 為了改造優(yōu)化異了醇合成菌株，代謝網(wǎng)絡模型模擬指導是至關重要的。有文獻報 道對異了醇合成菌株代謝網(wǎng)絡模型進行了基元模式分析，在大腸桿菌中通過途徑分析發(fā) 現(xiàn)維持NADH代謝平衡是厭氧異了醇合成的關鍵因素（Trinh CT(2012化lucidating and reprogramming Escherichia coli metabolisms for obligate anaerobic n-butanol and isobutanol production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 95 (4) : 1083-1094)，在枯草 芽抱桿菌中通過通量相關性分析則發(fā)現(xiàn)戊糖鱗酸途徑是提高NADPH促進異下醇合成的重 要革Ev點（Li SS, Wen JP，Jia XQ(2011)Engineering Bacillus subtilis for isobutanol production，by heterologous Ehrlich pathway construction and the biosynthetic 2-ketoisovalerate precursor pathway overexpression. Appl Microbiol Biotechnol 91 (3):577-589)。值得注意的是，這種基元模式分析只能采用精簡的代謝網(wǎng)絡模型（對大 腸桿菌研究了 79個代謝反應，對枯草芽抱桿菌則研究了 131個反應），未能全面考慮所有的 胞內(nèi)氧化還原代謝反應（如，NADH和NADPH分別參與了 300和100多個反應），這對還原力 代謝分析和靴點預測具有一定的片面性。因此，從還原力角度出發(fā)，采用更加全面的基因組 尺度代謝網(wǎng)絡模型，全局性地深入分析各種還原力調(diào)節(jié)方式對異了醇合成菌株整體代謝作 用規(guī)律，預測獲得最佳還原力調(diào)節(jié)祀點及其改造方式，是十分必要的。
[0004] 系統(tǒng)預測還原力調(diào)節(jié)祀點，需要綜合考慮還原力代謝反應的輔因子置換、敲除和 過表達等調(diào)節(jié)方式對異了醇合成菌株胞內(nèi)代謝的作用規(guī)律。然而，目前還沒有報道同時完 成該=種還原力調(diào)節(jié)方式的模擬預測，通常單一地針對敲除或過表達或輔因子替換，進行 模擬預測還原力調(diào)節(jié)祀點。而采用通量平衡分析（FBA)禪合代謝最小調(diào)節(jié)算法（M0MA)，為 嘗試模擬該=種還原力調(diào)節(jié)策略，預測異了醇合成還原力調(diào)節(jié)祀點提供了可能。進一步對 預測祀點進行改造，采用敲除、過表達或替換等簡單方法通常不能夠達到最佳胞內(nèi)還原力 狀態(tài)，還有可能造成過度調(diào)節(jié)引起菌株生長和產(chǎn)物合成能力下降。因此，為了充分調(diào)節(jié)還原 力代謝平衡，需要篩選和構建適用于異了醇合成菌株的還原力調(diào)節(jié)代謝通路，同時為了達 到最佳還原力狀態(tài)，防止過度調(diào)節(jié)，采用人工基因表達調(diào)節(jié)元件對還原力調(diào)節(jié)代謝通路進 行基因表達水平調(diào)節(jié)是十分重要的，其中人工組成型啟動子庫是典型的基因表達水平調(diào)節(jié) 元件，為構建還原力調(diào)節(jié)代謝通路提供了一種有力的工具。
[0005] 本發(fā)明首次從還原力代謝角度出發(fā)，采用基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型，模擬預測得 出異了醇合成菌株還原力代謝調(diào)節(jié)關鍵祀點一甘油醒-3-磯酸脫氨酶催化的代謝反應，并 指導構建來自Clostridium的NADP+-甘油-3-磯酸脫氨酶（gapN編碼）代謝通路（Martinez I, Zhu J, Lin H, Bennett GN, San KY(2008)Replacing Escherichia coli NAD-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)with a NADP-dependent enzyme from Clostridium acetobutylicum facilitates NADPH dependent pathways. Metab Eng 10 (6) : 352-359)，并通過不同強度的人工組成型啟動子調(diào)節(jié)gapN的表達水平，最終獲得了 一株異了醇合成菌株。本發(fā)明所提供的基于模型模擬設計還原力調(diào)節(jié)方式還未見報道，其 結合合成生物學中人工調(diào)控元件的精確調(diào)控胞內(nèi)還原力的方法，對構建大腸桿菌異了醇合 成菌株，具有迫切的現(xiàn)實意義和應用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對異了醇合成菌株的還原力平衡該一關鍵問題，提供了一種采用異了醇 合成菌株基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型，模擬預測出甘油醒-3-磯酸脫氨酶催化的代謝反應是 胞內(nèi)還原力調(diào)節(jié)關鍵祀點，理論指導構建依賴于NADP+-甘油-3-磯酸脫氨酶代謝通路，并 通過不同強度的人工組成型啟動子調(diào)節(jié)該代謝通路的表達水平，構建異了醇合成菌株的方 法。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用了如下技術方案：
[000引一種基于基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型理性調(diào)節(jié)胞內(nèi)還原力的異了醇合成菌株構建 方法，其步驟如下：
[0009] (1)在大腸桿菌MG1655基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型基礎上，根據(jù)初始異了醇合成菌 株LA02基因型，添加異了醇合成的代謝反應和異了醇運輸反應，獲得的異了醇合成菌株基 因組尺度代謝網(wǎng)絡模型；
[0010] (2)根據(jù)初始異了醇合成菌株濕實驗數(shù)據(jù)設定異了醇合成菌株基因組尺度代謝網(wǎng) 絡模型的約束條件，聯(lián)合采用代謝通量平衡分析算法和最小代謝調(diào)節(jié)算法模擬預測得出甘 油醒-3-磯酸脫氨酶為最關鍵還原力調(diào)節(jié)祀點；
[0011] 做針對步驟似模擬預測的關鍵祀點，構建和調(diào)節(jié)依賴于NADP的甘油醒-3-磯 酸脫氨酶代謝通路，從而調(diào)節(jié)異了醇合成菌株胞內(nèi)還原力狀態(tài)，構建得到一株異了醇合成 兩株。
[0012] 具體方法為；
[001引 （1)將含有alsS、ilvC和ilvD基因的質粒pACY化A09和含有kivd和7郵)基因 的質粒pTRCLAlO導入大腸桿菌LA01中，獲得初始異了醇合成菌株LA02。
[0014] (2)采用代謝通量平衡分析算法模擬計算胞內(nèi)各個還原力的代謝反應的初始代謝 通量，并依據(jù)各個還原力代謝反應的初始代謝通量，采用最小代謝調(diào)節(jié)算法模擬預測每個 還原力代謝反應的輔因子置換、敲除和過表達對菌株生長和異了醇合成等代謝通量變化， 計算每個候選還原力代謝反應的的表型系數(shù)，選取表型系數(shù)最大的還原力代謝反應為最關 鍵還原力調(diào)節(jié)祀點。
[0015] (3)針對模擬預測出的甘油醒-3-磯酸脫氨酶催化的代謝反應該一關鍵祀點，構 建依賴于NADP的甘油醒-3-磯酸脫氨酶代謝通路，并采用人工啟動子調(diào)節(jié)該通路表達水平 調(diào)節(jié)異了醇合成菌株胞內(nèi)還原力，從而調(diào)節(jié)異了醇合成菌株胞內(nèi)還原力，最終獲得一株高 效合成的異了醇合成菌株。
[0016] 人工啟動子調(diào)節(jié)的依賴于NADP的甘油醒-3-磯酸脫氨酶代謝通路分別存在于質 粒pTR化A13、pTR化A14、pTR化A15、pTR化A16和pTR化A17上；依賴于NADP的甘油醒-3-磯 酸脫氨酶代謝通路是由來自于Clostridium acetobut}di州m ATCC824的gapN基因編碼， gapN基因大小為1449bp，其序列為SEQ ID NO ;24 ;人工啟動子分別為BBa_J23105、BBa_ 123106、883_扣3118、883_扣3102和883_扣3100，其序列分別為569 10^;25,569 10^; 26,沈Q ID NO ;27,沈Q ID NO ;28 和沈Q ID NO ;29。
[0017] 人工啟動子調(diào)節(jié)的依賴于NADP的甘油醒-3-磯酸脫氨酶代謝通路具體步驟如 下：
[001 引 （1) W GeneBank 已報道中 Clostridium acetobutylicum ATCC824 的 gapN 基因 (NCBI-GeneID: 1119839)和組成型啟動子序列為依據(jù)分別設計設計引物BBa_J23105-F、 BBa_J23106-F、BBa_J23118-F、BBa_J23102-F、BBa_J23100-F 和 gapN-R，引物序列分別為為 沈Q ID NO ;30、沈Q ID NO ;31、沈QID NO ;32、沈Q ID NO ;33、沈Q ID NO ;：34 和沈Q ID NO ; 35,利用PCR獲得五個包含不同啟動子控制的gapN基因
[0019] 似然后將步驟（1)中的獲得的片段分別用化nl和Sail,雙酶切連接到相同雙酶 切的pTR化A10質粒上，獲得重組質粒pTR化A13、pTR化A14、pTR化A15、pTR化A16和pTR化A17
[0020] (3)將重組質粒pACY化A09分別與重組質粒pTR化A13、pTR化A14、pTR化A15、 pTR化A16和pTR化A17,共同轉化進入E.coli LA01中巧.coli MG1655菌株pflB基因缺陷 型），獲得5株不同的胞內(nèi)還原力調(diào)節(jié)的異了醇合成菌株；
[0021] (4)對步驟（3)中構建菌株進行搖瓶發(fā)酵，獲得高效異了醇合成菌株，其產(chǎn)量最大 可達到8g/L W上。
[0022] 發(fā)酵方法為；30~37攝氏度條件下培養(yǎng)，轉速200~25化pm，當細胞ODe。。增長到 0. 6~0. 8時，加入0. 1~ImM的IPTG進行異了醇誘導。
[002引培養(yǎng)基為；20~40g/L葡萄糖，5~lOg/L酵母浸粉，5~6g/L化2冊04 ? 12&0， 3 ~4g/L 皿2口04,0. 5 ~1.5g/L 化Cl，l ~2g/L 畑典1，0. 2 ~0. 6g/L M拆0"0. 01 ~0. 05g/ L CaCls和 1000 倍稀釋的 Trace mix A ;其中；Trace mix A 包含 2 ~4g/L H3BO3, 1 ~3g/ L MnCla ? 4&0, 0. 2 ~0. 8g/L ZnS04 ? 7&0, 0. 3 ~0. 5g/LNaMo04 ? 2&0, 0. 07 ~0. lOg/L CuS04 ? 5&0, and 49 ~60mg/L Co(N03)2 ? 6&0。
[0024] 下面根據(jù)具體載體圖和序列等對本發(fā)明詳細說明：
[00巧](1)針對異了醇合成途徑，構建了包括alsS、ilvC、ilvD、kivd和y化D的異了醇合 成途徑，獲得了初始大腸桿菌異了醇合成菌株，其具體步驟如下：
[0026] WpTRC99a為模板，設計引物