枯草芽孢桿菌的高絲氨酸脫氫酶基因滅活方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種枯草芽抱桿菌的高絲氨酸脫氨酶基因滅 活方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 賴氨酸是人和動物的必需氨基酸之一，賴氨酸不足時會限制其它氨基酸的利用， 發(fā)展賴氨酸生產(chǎn)對提高動物飼料利用效率具有重要的意義。工業(yè)上生產(chǎn)賴氨酸主要W發(fā)酵 法為主，但由于生產(chǎn)菌株產(chǎn)酸水平較低，生產(chǎn)規(guī)模較小，生產(chǎn)成本較高，難W和進(jìn)口產(chǎn)品競 爭等問題，因此，選育高產(chǎn)賴氨酸菌種成為當(dāng)務(wù)之急。
[0003] 目前，基因工程上通常采用基因敲除技術(shù)而獲得比原始菌株高產(chǎn)賴氨酸的菌株， 該敲除菌主要是通過同源重組的方式獲得，通過將帶有高絲氨酸脫氨酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 感受態(tài)細(xì)胞，篩選而來，但該方法步驟較多。常規(guī)方法是先擴(kuò)增高絲氨酸脫氨酶基因L臂， 再擴(kuò)增高絲氨酸脫氨酶R臂，然后將L臂和R臂連接，在L臂和R臂中間插入抗性基因，用 獲得的DNA片段或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至細(xì)菌，通過同源重組獲得基因敲除菌株。如何開發(fā)一種簡單、 快速的高絲氨酸脫氨酶基因滅活方法將有利于枯草芽抱桿菌高絲氨酸脫氨酶基因的滅活， 并能獲得賴氨酸產(chǎn)量高于原始菌株的突變株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種簡單、快速的枯草芽抱桿 菌的高絲氨酸脫氨酶基因滅活方法。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種枯草芽抱桿菌的高絲氨酸 脫氨酶基因滅活方法，該方法包括W下步驟：
[0006] a、構(gòu)建用于同源重組的PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒由pMD 18-T載體、卡納霉素抗 性基因和高絲氨酸脫氨酶基因組成，其中，該同源重組的DNA片段含有用于替代待滅活基 因的高絲氨酸脫氨酶基因W及在高絲氨酸脫氨酶基因中間部位炬sePl酶切位點）插入的 卡納霉素抗性基因；
[0007] b、從重組質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增高絲氨酸脫氨酶基因W及在高絲氨酸脫氨酶基因中間 部位插入的卡納霉素抗性基因，使PCR產(chǎn)物單鏈化，將所述單鏈PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至枯草芽抱桿 菌感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化子，并篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，即高絲氨酸脫氨酶基因滅活的突變株。 在本發(fā)明中，將所述單鏈PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至枯草芽抱桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法為電轉(zhuǎn)化法，當(dāng) 然，也可采用本領(lǐng)域內(nèi)的其它現(xiàn)有常規(guī)方法。
[000引其中，位于該卡納霉素抗性基因兩側(cè)的滿足同源重組要求的側(cè)翼序列與待滅活基 因兩側(cè)的側(cè)翼序列相同，其基因序列為在高絲氨酸脫氨酶基因的BsePl酶位點插入了卡納 霉素抗性基因的基因片段。
[0009] 本發(fā)明方法相對現(xiàn)有將高絲氨酸脫氨酶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌感受態(tài)細(xì)胞 的技術(shù)，更為簡單、省時。本方法直接擴(kuò)增高絲氨酸脫氨酶全長基因，直接通過BsePl酶切 后插入抗性基因，方法簡單快速有效，且獲得的突變株的賴氨酸含量要明顯高于原始菌株。
【附圖說明】
[0010] 圖1是枯草芽抱桿菌PA105和高絲氨酸脫氨酶基因滅活菌株的PCR電泳結(jié)果圖。
[001U 其中；1:2000bp MA服ER，2:5000bp MA服ER，3: W枯草芽抱桿菌PA105細(xì)菌培養(yǎng)物 為模板擴(kuò)增高絲氨酸脫氨酶基因所得的PCR片段1300bp左右，4: W突變株（枯草芽抱桿菌 化13-hom: :Km)細(xì)菌培養(yǎng)物模板擴(kuò)增高絲氨酸脫氨酶基因所得的PCR片段2300bp左右。
【具體實施方式】
[0012] W下實施例僅用于說明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍，如未特別說明，本發(fā) 明所用方法為常規(guī)技術(shù)，所用試劑均購自生化商店。
[0013] 實施例1枯草芽抱桿菌PA105高絲氨酸脫氨酶基因滅活
[0014] 枯草芽抱桿菌PA105由本申請人所在實驗中屯、提供，保藏編號為CCTCC; M2011328。
[0015] 1、枯草芽抱桿菌感受態(tài)制備用培養(yǎng)基：
[0016] GMI 培養(yǎng)基：1血lOXSpizizen salts、0. 1血 10 % 酵母粉、0. 25血20 % 葡萄糖、 0. 2血1 %水解酪蛋白、0. 2血0. 25%所需氨基酸，補(bǔ)充滅菌蒸饋水至總體積10血。
[0017] GMII 培養(yǎng)基：1 血 10XSpizizensalts、0. 05血 10 % 酵母粉、0. 25血20 % 葡萄 糖、0.041111^%水解酪蛋白、0.2血0.25%所需氨基酸、0.05血0.1111〇1/1〔3(：12、1血25111111〇1/ LMgC12,補(bǔ)充滅菌蒸饋水至總體積10血。
[001 引 lOXSpizizen salts 母液；15 % 馬冊04 ?抓20、6 % 皿2口04、2 % (NH4)2S04、0. 2 % M拆04及1 %巧樣酸鋼溶于75. 8 %蒸饋水中，6. 6 X 10中a高壓滅菌，室溫貶存。
[0019] LB液體培養(yǎng)基；膜蛋白腺lOg、酵母浸出物5g、氯化鋼lOg、蒸饋水1000ml，PH值 6. 8-7. 2〇
[0020] LB固體培養(yǎng)基；膜蛋白腺lOg、酵母浸出物5g、氯化鋼lOg、瓊脂粉15g、蒸饋水 1000ml，PH 值 6. 8-7. 2。
[0021] 2、枯草芽抱桿菌PA105感受態(tài)細(xì)胞制備方法；
[0022] 從本實驗室保存的枯草芽抱桿菌PA105菌株薩取一滿環(huán)，在新鮮LB固體平板上劃 線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于2. 5mL LB液體培養(yǎng)基中，30°CW 130-18化/min振蕩培養(yǎng)過夜， 將過夜培養(yǎng)物按10 %接種量接種于2. 5血新鮮的GMI中，37°C W 200-22化/min振蕩培養(yǎng) 3. 5h，再將培養(yǎng)物進(jìn)行第二次傳代，接種于5mLGMII培養(yǎng)基中，枯草芽抱桿菌PA105按5%接 種量進(jìn)行第二次傳代，37°C W 200-22化/min振蕩培養(yǎng)90min，取1血培養(yǎng)物，500化/min室 溫離屯、5min，用1/10體積上清液重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為枯草芽抱桿菌PA105感受態(tài)細(xì)胞。
[0023] 3、pMD18-T-hom: :Km 質(zhì)粒構(gòu)建；
[0024] 3. lpMD18-T-hom 質(zhì)粒構(gòu)建；
[0025] 設(shè)計上游引物序列為；TTGAAAGCGATTCGTGTAGG(SEQ ID No. 1)，下游引物序列為； TTAGCTCCAACCGTTCCCTTCT(SEQ ID No. 2)，上下游引物由上海生物工程有限公司合成，W 該枯草芽抱桿菌PA105為模板，對高絲氨酸脫氨酶基因hom進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系： 10X擴(kuò)增緩沖液10ul、4種dNTP混合物各200umol/L、引物各10~lOOpmol、模板DNA 0. 1~化肖、化9 DM聚合酶2.加、1. 5mmol/L Mg"、加雙或S蒸水至lOOul ;PCR反應(yīng)條件為； 95°C 5min ;95°C lmin，56°C lmin，72°C Imin ;72°C lOmin，循環(huán)數(shù) 30。
[0026] 獲得的PCR產(chǎn)物（即高絲氨酸脫氨酶基因hom)連接至pMDlS-T載體上（pMDlS-T 購買自上海生物工程有限公司），連接體系為；高絲氨酸脫氨酶基因PCR產(chǎn)物6ul、pMD18-T 載體化l、TJigase 2ul、T4buffer 2. 5ul及水12. 5ul，總共25ul，16°C過夜連接，即為連接 產(chǎn)物。
[0027] 取lOul上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至lOOul商業(yè)化的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（購買自上海 生物工程有限公司），37°C過夜培養(yǎng)后，在含lOug/血氨節(jié)青霉素的LB平板上生長的大腸桿 菌克隆即為陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定后獲得pMD18-T-hom質(zhì)粒。
[002引 3. 2卡納霉素抗性基因表達(dá)盒構(gòu)建；
[0029] 設(shè)計上游引物；TTG-GCGCGC-TGTTTGCAAGCAGCAGATT (SEQ ID No. 3)，和下游引物； TTG-GCGCGC-GTATCCGCTCATGAATTAAT(SEQ ID No. 4)，上下游引物由上海生物工程有限公司 合成。其中-GCGCGC-為BsePUBss肥）酶切位點。W祀T-28a(+)載體（購買自上海生物工 程有限公司）為模板，擴(kuò)增卡納抗性基因，PCR反應(yīng)體系為；10X擴(kuò)增緩沖液10ul、4種dNTP 混合物各20