匹馬霉素a菌株的代謝工程優(yōu)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)，特別設(shè)及一株匹馬霉素A菌株的代謝工程優(yōu)化方法。 技術(shù)背景
[0002] 匹馬霉素的結(jié)構(gòu)簡單，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是一種常用的多締類抗生素，被廣泛用作食 品（如奶酪等非滅菌食物）防腐添加劑、抗真菌獸藥W及用于角膜炎治療。在目前最常用 的四種多締類抗生素（匹馬霉素、兩性霉素B、制霉菌素及殺念菌素等）中，匹馬霉素的溶血 毒性最低，但其抗真菌活性同樣也相對較低。相對偏低的藥理性質(zhì)，嚴重限制了匹馬霉素在 臨床中的應(yīng)用價值。為獲得抗真菌活性更高，溶血毒性更低的匹馬霉素衍生物，我們通過基 因工程改造的方法，在匹馬霉素高產(chǎn)菌株L10的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了 P450單加氧酶基因pimG失 活菌株胞〇1 (專利申請?zhí)枮?01410592642. 5)。
[0003] 經(jīng)發(fā)酵驗證，菌株胞01可W產(chǎn)生兩種具有抗真菌活性的匹馬霉素衍生物，分別為 匹馬霉素AQ2-脫駿-12甲基-匹馬霉素）與匹馬霉素B(4, 5-脫環(huán)氧-12-脫駿-12甲 基-匹馬霉素）。其中，匹馬霉素A的活性是匹馬霉素的2倍，而其毒性不足匹馬霉素的 1/4,是一種高效低毒的匹馬霉素衍生物，具有良好的應(yīng)用前景；匹馬霉素B的毒性非常低， 但是其活性僅為匹馬霉素的1/2左右，較低的活性使其臨床應(yīng)用受到限制。因此，通過基因 工程改造的方法，消除菌株胞〇1中低活性匹馬霉素B的產(chǎn)生，并進一步提高高效低毒匹馬 霉素A的產(chǎn)量，將極大的推動匹馬霉素A的工業(yè)化生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟價值。此外，通過 生化實驗驗證，我們發(fā)現(xiàn)，匹馬霉素B是匹馬霉素A未發(fā)生C4-巧位環(huán)氧化的前體，因此，我 們在胞01菌株中嘗試通過超量表達負責(zé)編碼環(huán)氧化酶的基因pi血，使匹馬霉素B完全轉(zhuǎn)化 為匹馬霉素A，從而，完全消除匹馬霉素B的產(chǎn)生，并提高匹馬霉素A的產(chǎn)量，進而達到優(yōu)化 產(chǎn)生菌株的目的。。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的，在于通過高表達匹馬霉素AQ2-脫駿-12甲基-匹馬霉素）生物 合成基因簇后修飾基因pi血，優(yōu)化其產(chǎn)生菌株，提高高效低毒匹馬霉素A的產(chǎn)量。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)方案；一種匹馬霉素A優(yōu)產(chǎn)菌株 的代謝工程優(yōu)化方法，通過在菌株Streptomyces chattanoogensisQZOl中過表達后修飾基 因pi血，使匹馬霉素B完全轉(zhuǎn)化為匹馬霉素A，使匹馬霉素A的產(chǎn)量得W提高，并完全消除 菌株QZ01中低效組份匹馬霉素B的產(chǎn)生。
[0006] 所述pi血是P450單加氧酶基因，負責(zé)編碼催化匹馬霉素A中C4-巧位環(huán)氧鍵的 形成，pi血的基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述基因pi血的過表達構(gòu)建步驟如下：
[000引第一步；設(shè)計并構(gòu)建用于基因pi血過表達的整合型質(zhì)粒I ;
[0009] 第二步：將第一步構(gòu)建得到的質(zhì)粒I結(jié)合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入受體菌株胞01中；
[0010] 第S步：通過對突變株的PCR驗證及阿伯拉霉素抗性驗證篩選得到過表達菌株 QZ03〇
[0011] 所述質(zhì)粒I是在質(zhì)粒pIB139的Ndel/EcoRI位點插入1. 2化測序確認的基因pi血 的PCR片段構(gòu)建而成。
[0012] 本發(fā)明可W使后修飾基因pi血的轉(zhuǎn)錄水平提高約7倍左右，進而大幅度提高 C4-巧位環(huán)氧化效率，使低效匹馬霉素B完全轉(zhuǎn)化為高效低毒匹馬霉素A，并使匹馬霉素A 的產(chǎn)量提高了 20 %，極大推動了匹馬霉素A的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[001引圖1為過表達菌株胞03的后修飾基因pi血轉(zhuǎn)錄變化示意圖。
[0014] 具體實施方法
[001引步驟一：整合型質(zhì)粒I的構(gòu)建
[0016] W菌株 Streptomyces chattanoogensis QZ01 的基因組 DNA 為模板，使用引物 pi血-F/R，通過PCR擴增得到完整的基因pi血，通過基因測序確認PCR片段的正確性；在質(zhì) 粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入測序正確的pi血基因片段（Ndel/EcoRI酶切位點）；通 過上述方法得到用于基因pi血過表達的質(zhì)粒I。在37°C水浴條件下，采用Ndel、EcoRI兩 種限制性內(nèi)切酶進行酶切處理可W觀察到1.化b的目標DM條帶，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0017] 步驟二；將整合型質(zhì)粒I通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的策略導(dǎo)入菌株胞01，并篩選得到基因 pi血過表達的菌株胞03。
[001引將已構(gòu)建完成用于基因過表達的質(zhì)粒I轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌宿主E.coli ET12567(含有PUZ8002質(zhì)粒）中。取該轉(zhuǎn)化子于含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素S種 抗生素的LB中于37°C過夜培養(yǎng)，用相同的培養(yǎng)基，將過夜培養(yǎng)物按10%的比例轉(zhuǎn)接一次并 培養(yǎng)化，然后用新鮮的LB溶液漂洗菌體W除去培養(yǎng)物中的抗生素。于此同時制備菌株胞01 的新鮮抱子約109個，用TES溶液漂洗2~3次之后再用2mLTES溶液懸浮抱子，于50°C熱激 lOmin后，冷卻至室溫，等體積加入2X抱子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)液后于37°C培養(yǎng)2.化，并用新鮮的 LB溶液漂洗抱子2~3次。將預(yù)萌發(fā)的抱子與之前制備的大腸桿菌宿主菌E. coli ET12567 混合（抱子和宿主菌的比例約為10 ;1)均勻后涂布于YMG平板，待平板吹干后轉(zhuǎn)移至30°C 培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)1化后取出平板，分別取阿伯拉霉素和蒙晚酬酸兩種抗生素混勻于ImL無 菌水中，覆蓋于YMG平板上，將平板驚干后轉(zhuǎn)移至30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般3~5天后可見 平板上有單菌落結(jié)合子長出，采用pi血1-F/R為引物，通過菌絲體PCR驗證和抗性驗證的方 法驗證結(jié)合子正確，即得到過表達菌株胞03。
[0019] 上述步驟二中所用到的引物序列如表1所示：
[0020] 表 1
[0021]
【主權(quán)項】
1. 匹馬霉素 A菌株的代謝工程優(yōu)化方法，其特征在于：通過在菌株Streptomyces chattanoogensisQZOl中過表達后修飾基因 pimD，使匹馬霉素 B完全轉(zhuǎn)化為匹馬霉素 A，使 匹馬霉素 A的產(chǎn)量得以提高，并完全消除菌株QZOl中低效組份匹馬霉素 B的產(chǎn)生。
2. 如權(quán)利要求1所述的匹馬霉素 A菌株的代謝工程優(yōu)化方法，其特征在于：所述pimD 是P450單加氧酶基因，負責(zé)編碼催化匹馬霉素 A中C4-C5位環(huán)氧鍵的形成，pimD的基因序 列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的匹馬霉素 A菌株的代謝工程優(yōu)化方法，其特征在于：所述基 因 pimD的過表達構(gòu)建步驟如下： 第一步：設(shè)計并構(gòu)建用于基因 pimD過表達的整合型質(zhì)粒I ; 第二步：將第一步構(gòu)建得到的質(zhì)粒I結(jié)合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入受體菌株QZOl中； 第三步：通過對突變株的PCR驗證及阿伯拉霉素抗性驗證篩選得到過表達菌株QZ03。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的匹馬霉素 A菌株的代謝工程優(yōu)化方法，其特征在于：所述質(zhì) 粒I是在質(zhì)粒PIB139的Ndel/EcoRI位點插入I. 2kb測序確認的基因 pimD的PCR片段構(gòu) 建而成。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種匹馬霉素A菌株的代謝工程優(yōu)化方法，是通過在菌株Streptomyces chattanoogensisQZ01中過表達后修飾基因pimD，使匹馬霉素B完全轉(zhuǎn)化為匹馬霉素A，使匹馬霉素A的產(chǎn)量得以提高，并完全消除菌株QZ01中低效組份匹馬霉素B的產(chǎn)生。本發(fā)明利用代謝工程方法構(gòu)建了一株高效低毒的12-脫羧-12-甲基匹馬霉素優(yōu)產(chǎn)菌株，該菌株在實現(xiàn)高效低毒匹馬霉素A產(chǎn)量提高20％的基礎(chǔ)上，消除了副產(chǎn)物匹馬霉素B的產(chǎn)生，為匹馬霉素A的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12R1-465, C12N15-53, C12N15-76
【公開號】CN104630254
【申請?zhí)枴緾N201510075420
【發(fā)明人】白林泉, 齊震, 康前進, 姜春艷
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年2月12日