帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體及其在溶酶體分離中的應用
【專利說明】帶FI ag標簽的LAMP1真核表達載體及其在溶酶體分離中的 應用 【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，特別涉及一種帶Flag標簽的LAMP1 (溶酶體膜 蛋白1)真核表達載體及其在溶酶體分離中的應用。 【【背景技術】】
[0002] 溶酶體（lysosome)是真核細胞中由單層脂蛋白膜包繞的含一系列酸性水解酶的 小體，是細胞內吞和細胞自瞻兩條代謝途徑的共同終點。溶酶體既能通過與吞瞻體融合，酸 化水解通過內吞途徑進入細胞的生物大分子物質，調節(jié)細胞水平的信號傳遞，又能通過與 自瞻體融合，降解通過自瞻途徑包裹到自瞻體中的細胞器和內源性生物大分子，為細胞提 供生物合成的新原料。通過分子生化手段分離溶酶體對于研究細胞內吞和細胞自瞻兩條代 謝途徑意義重大。傳統(tǒng)應用于分離溶酶體的方法主要是密度梯度離也。密度梯度離也法是 指用一定的介質在離也管內形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混息液或勻漿液置于 介質的頂部，通過重力或離也力場的作用使細胞裂解液分層、分離。該方法通過利用細胞中 不同細胞器的沉降系數(shù)不同，在一定離也力作用下，細胞器會分布到密度梯度的不同區(qū)域 中，最后再通過免疫印跡法鑒定出溶酶體所分布的區(qū)域，并將該一區(qū)域都作為溶酶體分離 出來。
[0003] 密度梯度離也法分離溶酶體耗時長，分離效率低，而且無法得到純度較高的溶酶 體。LAMP1是溶酶體表面特異性定位的膜蛋白，被廣泛的用作溶酶體的標識物。LAMP1蛋白 分子的大部分區(qū)域定位于溶酶體的內腔中，僅有C端一小部分跨過溶酶體膜，暴露在溶酶 體表面與胞漿接觸。依據(jù)LAMP1的特性，我們W LAMP1蛋白作為溶酶體的標識物，用免疫沉 淀的方法分離溶酶體，會簡化了純化步驟，提高了分離得到的溶酶體的純度。而現(xiàn)有的祀向 細胞內源性LAMP1的抗體特異性和效價都不高，不離于高效的分離溶酶體。用傳統(tǒng)的密度 濃度梯度法分離溶酶體具有耗時長，樣品需求量大，而且無法得到純度較高的溶酶體。 【
【發(fā)明內容】
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[0004] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體在溶酶體分 離中的應用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過W下技術方案實現(xiàn)；一種帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體， 其中所含的帶Flag標簽的LAMP1的核巧酸序列為幼日SEQ ID NO. 1所示）；
【主權項】
1. 一種帶Flag標簽的LAMPl真核表達載體，其特征在于其中所含的帶Flag標簽的 LAMPl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述的帶Flag標簽的LAMPl真核表達載體，其特征在于：所述帶 Flag標簽的LAMPl真核表達載體所用真核表達載體為pcDNA3. 1 ( + )載體。
3. 權利要求1或2所述的帶Flag標簽的LAMPl真核表達載體的構建方法，其特征在于 包括如下步驟： 以Hela細胞的cDNA為模板，用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3序列所示的特異性引物 擴增得到含BamH I酶切位點及Xho I酶切位點的LAMPl-Flag片段；分別對PCR擴增的 LAMPl-Flag基因與pcDNA3. 1 ( + )載體使用限制性內切酶BamH I和限制性內切酶Xho I進 行雙酶切，純化酶切產物；將載體和LAMPl-Flag基因片段按照質量比為2. 5:1-5:1的比例 在DNA連接酶的作用下進行連接并轉化，挑取單克隆擴大培養(yǎng)并提取重組質粒，通過檢測， 獲得重組表達載體pcDNA3. I ( + )-LAMPl-Flag。
4. 權利要求1或2所述的帶Flag標簽的LAMPl真核表達載體應用于研究溶酶體代謝 機制的分子細胞生物學技術領域。
5. 權利要求1或2所述的帶Flag標簽的LAMPl真核表達載體在溶酶體分離中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體公開了一種帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體及其應用。本發(fā)明所述帶Flag標簽的LAMP1真核表達載體中帶Flag標簽的LAMP1的核苷酸序列如SEQNO.1所示，通過將LAMP1基因與Flag標簽蛋白基因構成融合基因，利用載體上的啟動子和信號序列來控制融合基因的表達，然后采用免疫沉淀的方式分離溶酶體，操作簡便，富集效率高，結果易于檢測，成本低，可應用于高效的分離溶酶體。
【IPC分類】C12N15-85, C12N5-07, C12N15-66
【公開號】CN104630264
【申請?zhí)枴緾N201310560532
【發(fā)明人】張磊, 李紅昌, 楊詩涵
【申請人】中國科學院深圳先進技術研究院
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2013年11月12日