一種低分子量殼聚糖敷料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)用殼聚糖敷料領(lǐng)域，具體設(shè)及一種低分子量殼聚糖敷料的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 殼聚糖在化工、食品、醫(yī)療等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用。殼聚糖是甲殼素的脫己酷化產(chǎn) 物，在自然界中的儲(chǔ)量非常豐富，廣泛存在于郵、蟹和昆蟲(chóng)的外殼及藻類、菌類的細(xì)胞壁中， 是年產(chǎn)量?jī)H次于纖維素的第二大天然高分子，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一天然堿性多糖。殼 聚糖是分子量通常在幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)不等，因其分子內(nèi)有較強(qiáng)的氨鍵作用，只能溶于稀酸 溶液中，而不能直接溶于水中，導(dǎo)致使用范圍受到較大的限制。
[0003] 目前，世界各國(guó)對(duì)低分子量殼聚糖的制備方法的研究非常多，主要制備方法有酸 降解法、氧化降解法、酶降解法、合成法和物理降解法。酸降解法是制備單糖和一系列相應(yīng) 低分子量殼聚糖主要途徑之一，但是酸降解法不好控制，選擇性差、分離純化比較困難，產(chǎn) 率較低，在制備低分子量殼聚糖時(shí)主要得到的單糖，其次是雙糖，很難得到所需活性的低分 子量殼聚糖；氧化降解法是目前研究較多的方法，其中&〇2氧化法更有大量文獻(xiàn)報(bào)道，但是 氧化降解存在的最大問(wèn)題是反應(yīng)過(guò)程不易控制，容易發(fā)生褐變，在降解過(guò)程中引入了各種 反應(yīng)試劑，增加了控制降解副反應(yīng)及降解產(chǎn)物分離純化的難度；酶降解法是用專一性或非 專一性酶對(duì)殼聚糖進(jìn)行生物降解方法，能夠得到平均相對(duì)分子量較低的低聚糖和單糖。在 整個(gè)降解過(guò)程中無(wú)其它反應(yīng)試劑加入，不至于發(fā)生其它副反應(yīng)，降解條件溫和，降解過(guò)程及 產(chǎn)物分子質(zhì)量分布較易控制，缺點(diǎn)是所使用的酶較為特殊，成本高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。合成法的 研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但合成過(guò)程設(shè)及基團(tuán)保護(hù)和基團(tuán)脫去等過(guò)程，步驟較為復(fù)雜，目前 主要研究利用酶法合成，已經(jīng)取得一定成果，但還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。物 理降解法主要是利用微波、超聲波、丫射線等物理方式處理也可降解殼聚糖，但是物理降 解法也存在一定的局限性，目前也不容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
[0004] 在殼聚糖生產(chǎn)工業(yè)中，使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿制備殼聚糖的比較多，該過(guò)程使用的強(qiáng)堿的 濃度在40% ~ 60%，反應(yīng)的溫度一般在100~140°C，該方法制備殼聚糖的過(guò)程中產(chǎn)生大量的 酸堿廢液，污染環(huán)境，而且過(guò)程難控制，同時(shí)殘留酸堿容易殘留，導(dǎo)致臨床過(guò)敏。在臨床應(yīng) 用中，通常是將殼聚糖與其它功能成分的物質(zhì)復(fù)合在一起制備成止血粉或是其它的醫(yī)用敷 料。中國(guó)專利名稱為"一種止血粉及其制備方法(公開(kāi)號(hào)為103690956 A)"的專利，公開(kāi)了 使用化學(xué)法制備殼聚糖，并將殼聚糖和抗菌物質(zhì)復(fù)合制備醫(yī)用敷料；另一篇中國(guó)專利名稱 為"一種醫(yī)用殼聚糖敷料及其應(yīng)用（公開(kāi)號(hào)為CN 1887358A)"的專利，也是公開(kāi)了將殼聚糖 和其它藥用成分復(fù)合制備殼聚糖敷料。單獨(dú)將殼聚糖制備成粉狀抗菌、止血敷料的應(yīng)用目 前未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種低分子量殼聚糖敷料的制備方法，該方法利用微生物發(fā) 酵制備甲殼素，并用超聲技術(shù)疏松甲殼素的晶體結(jié)構(gòu)，然后使用低濃度的堿液可滲入甲殼 素分子內(nèi)部脫除甲殼素上的己酷氨基，制備低分子量殼聚糖，該方法可W大大減少酸堿的 使用量，降低對(duì)環(huán)境的污染程度，且容易工業(yè)化生產(chǎn)。使用該低分子量殼聚糖制備的低分子 量殼聚糖敷料避免了過(guò)敏現(xiàn)象的產(chǎn)生，且使用方便，具有很好的抗菌性和止血效果。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種低分子量殼聚糖敷料的制備方法，具體制備工藝步 驟如下： (1)南極磯郵在4°C解凍后，通過(guò)組織搗碎機(jī)進(jìn)行搗碎整只郵，將搗碎后的組織液放入 發(fā)酵罐中，在發(fā)酵罐中接種體積分?jǐn)?shù)為10%的活化后的乳酸菌，活化培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基， 發(fā)酵的初始抑為6. 0~7. 5,發(fā)酵的溫度為37~45°C，發(fā)酵時(shí)間為48~9化，發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾 濾液，收集濾渣，并用蒸饋水多次沖洗濾渣，去除蛋白質(zhì)、乳酸巧、郵青素等雜質(zhì)，沖洗至無(wú) 色后烘干濾渣。乳酸菌在發(fā)酵罐中可W產(chǎn)生大量的乳酸，利用發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的乳酸和內(nèi)源 性蛋白酶脫除南極磯郵中的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，無(wú)需添加鹽酸、己酸、巧樣酸、氨氧化鋼等酸 堿性物質(zhì)脫除南極磯郵中的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)。
[0007] (2)將步驟（1)中得到的濾渣和堿液按W/V=l ;5~1 ;15 (質(zhì)量體積比)混合均勻后， 在50~80°C條件下超聲波處理4~12 h，為了實(shí)現(xiàn)在較低堿液濃度下能脫除甲殼素上的己酷 基，在堿液浸泡的時(shí)候，結(jié)合超聲波疏松甲殼素的晶體結(jié)構(gòu)，使堿液可滲入甲殼素分子內(nèi)部 脫除甲殼素上的己酷氨基； (3)超聲結(jié)束后，用酸性溶液將混合液調(diào)至中性，然后用蒸饋水反復(fù)沖洗多次，將洗 凈后的固體物溶解在體積濃度為1%的己酸中，濾去不溶物，收集濾液，并用堿液調(diào)節(jié)濾液 pH=7. 0后，靜置0. 5-1 h，再次過(guò)濾出濾液析出的固體物，用蒸饋水清洗固體物后烘干、粉 碎、過(guò)篩，得到粉末狀的低分子質(zhì)量殼聚糖固體粉末。本發(fā)明利用微生物發(fā)酵制備甲殼素， 并用超聲技術(shù)疏松甲殼素的晶體結(jié)構(gòu)，然后使用低濃度的堿液可滲入甲殼素分子內(nèi)部脫除 甲殼素上的己酷氨基，制備低分子量殼聚糖，該方法污染小，反應(yīng)溫度低，操作簡(jiǎn)單，且容易 生產(chǎn)。該方法中用1%的己酸溶解殼聚糖，然后調(diào)節(jié)抑=7.0后析出的殼聚糖，其脫己酷度比 較均勻。
[000引（4)將步驟（3)中得到的粉末狀的低分子質(zhì)量殼聚糖進(jìn)行包裝、滅菌，即得低分子 量殼聚糖敷料。
[0009] 更進(jìn)一步的，所述的步驟（2)中的堿液的質(zhì)量濃度為15% ~ 25%，所述的堿液為 化OH溶液或KOH溶液。本發(fā)明使用的堿液的濃度明顯低于工業(yè)生產(chǎn)中濃度為40%~60%的 堿液，減少了生產(chǎn)工藝中的污染情況。
[0010] 更進(jìn)一步的，所述的步驟（3)中的酸性溶液為4mol/L的肥1溶液。
[OCm] 更進(jìn)一步的，所述的步驟（3)中的堿液為0. 1 mol/L的化OH溶液。
[0012] 更進(jìn)一步的，所述的步驟（4)中的滅菌方法為福照滅菌，滅菌劑量為16~25 KGY，滅 菌時(shí)間為5~7 h，本發(fā)明選用的滅菌劑量和滅菌時(shí)間可W確保，最終得到的低分子量殼聚糖 敷料是無(wú)菌產(chǎn)品。
[0013] 更進(jìn)一步的，所述的低分子量殼聚糖的分子量為5000~10000 Da,脫己酷度為 709(^85%。本發(fā)明選用南極磯郵，利用微生物發(fā)酵和超聲波技術(shù)制備得到的低分子質(zhì)量殼聚 糖具有更好的抗菌、止血效果，且減少了過(guò)敏反應(yīng)。
[0014] 本發(fā)明的有益效果為；（1)本發(fā)明制備方法中用低濃度堿液代替高濃度堿液不僅 可w大大減少酸堿的使用量，降低對(duì)環(huán)境的污染程度，而且得到的敷料抗菌性能有所提高， 減少了過(guò)敏現(xiàn)象產(chǎn)生；（2)本發(fā)明選用南極磯郵利用微生物發(fā)酵和超聲波技術(shù)制備得到的 低分子質(zhì)量殼聚糖及其敷料具有更好的抗菌、止血效果，且減少了過(guò)敏反應(yīng)，可W在傷口擦 傷、大量出血時(shí)，噴灑該敷料即可有效的發(fā)揮止血作用；（3)本發(fā)明中用1%的己酸溶解殼聚 糖，然后調(diào)節(jié)抑=7. 0后析出的殼聚糖，其脫己酷度比較均勻；（4)本發(fā)明制備的低分子量殼 聚糖敷料在臨床應(yīng)用中具有很好的抗菌效果，噴灑在創(chuàng)面可W有效的殺死創(chuàng)面的細(xì)菌，防 止創(chuàng)面的二次感染；（5)本發(fā)明制備的低分子量殼聚糖敷料具有很好的生物相容性，無(wú)致 敏性，無(wú)毒性。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0016] 實(shí)施例1 (1)南極磯郵在4°C解凍后，通過(guò)組織搗碎機(jī)進(jìn)行搗碎整只郵，稱取搗碎后的組織液 lOOg放入發(fā)酵罐中，在發(fā)酵罐中接種體積分?jǐn)?shù)為10%的活化后的乳酸菌，活化培養(yǎng)基為MRS 培養(yǎng)基，發(fā)酵的初始抑為6. 0,發(fā)酵的溫度為37 °C，發(fā)酵時(shí)間為48 h，發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾濾 液，收集濾渣，并用蒸饋水多次沖洗濾渣，去除蛋白質(zhì)、乳酸巧、郵青素等雜質(zhì)，沖洗至無(wú)色 后烘干濾渣。乳酸菌在發(fā)酵罐中可W產(chǎn)生大量的乳酸，利用發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的乳酸和內(nèi)源性 蛋白酶脫除南極磯郵中的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)，無(wú)需添加鹽酸、己酸、巧樣酸、氨氧化鋼等酸堿 性物質(zhì)脫除南極磯郵中的礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)。
[0017] (2)將步驟（1)中得到的濾渣和堿質(zhì)量濃度為15%的化0H溶液按質(zhì)量體積比為W/ V=l;5混合均勻后，在50°C條件下超聲波處理4 h。為了實(shí)現(xiàn)在較低堿液濃度下能脫除甲 殼素上的己酷基，在堿液浸泡的時(shí)候，結(jié)合超聲波疏松甲殼素的晶體結(jié)構(gòu)，使堿液可滲入甲 殼素分子內(nèi)部脫除甲殼素上的己酷氨基。
[0018] (3)超聲結(jié)束后，用酸性溶液為4 mol/L的肥1溶液將混合液調(diào)至中性，然后用蒸 饋水反復(fù)沖洗多次，將洗凈后的固體物溶解在體積濃度為1%的己酸中，濾去不溶物，收集 濾液，并用堿液調(diào)節(jié)濾液抑=7. 0后，靜置0. 5 h，再次過(guò)濾出濾液析出的固體物，用蒸饋水 清洗固體物后烘干、粉碎、過(guò)篩，得到粉末狀的低分子質(zhì)量殼聚糖固體粉末。此方法得到的 低分子量殼聚糖的分子質(zhì)量為10000 Da、脫己酷度為70%。本發(fā)明利用微生物發(fā)酵制備甲 殼素，并用超聲技術(shù)疏松甲殼素的晶體結(jié)構(gòu)，然后使用低濃度的堿液可滲入甲殼