抗稻瘟病基因Pi9的特異性CAPS標(biāo)記Pi9caps及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種抗稻癌病基因Pi9的特異性CAI^S標(biāo)記Pi9caps及其應(yīng)用，屬于農(nóng) 作物分子遺傳育種學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半W上的人口 W稻米為主食。稻 癌病是影響水稻產(chǎn)量的主要病害，位居真菌病害之首，全球每年因稻癌病造成的水稻減產(chǎn) 達(dá)10 %~30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)40 %~50%，甚至顆粒無收。實(shí)踐證明，利用抗稻癌病基因 是控制稻癌病害最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的方法。到目前為止，在水稻中已至少報(bào)道了 68個(gè)抗稻 癌病位點(diǎn)共83個(gè)主效基因，該些基因成簇地分布于除第3染色體外的所有水稻染色體上， 已經(jīng)克隆的有 24 個(gè)，它們分別是 Pib, Pi-ta, Pi9, Piz-t, Pi2, Pid2, Pi36, Pi37,化r2, P化-m, P巧，Pid3, pi21, Pit, Pbl, Pish, Pik-p, Pik, Pia, P巧4, Pi25, Pi 1，P巧0, P巧4rh (國(guó)家水 稻數(shù)據(jù)庫(kù)中屯、ht1:p://www. ricedata. cn/gene/gene_pi. htm)。然而，盡管已經(jīng)克隆的抗稻 癌病基因數(shù)量眾多，但真正具有廣譜抗性的卻很少，在該些已克隆的抗稻癌病基因中，來源 于小粒野生稻的Pi9被多個(gè)研究組證實(shí)對(duì)收集自世界各地的稻癌病菌均具有廣譜抗性（如 et. al.，2006 ;張國(guó)民等，2010 ;)，因此在水稻抗稻癌病育種中，將Pi9基因?qū)氲剿竟歉?親本材料中就顯得尤為必要。
[0003] 酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved Amplified Polymo;rphism Sequences, CAP巧 CAPS技術(shù)又稱為PCR - RFLP，它實(shí)質(zhì)上是PCR技術(shù)與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性巧estriction 化agment Length Polymo巧hism，RFLP)技術(shù)結(jié)合的一種方法。CAPS的基本原理是利用己 知位點(diǎn)的DNA序列資源設(shè)計(jì)出一套特異性的PCR引物（19-27bp)，然后用該些引物擴(kuò)增該位 點(diǎn)上的某一 DNA片段，接著用一種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳分 離酶切片段，染色并進(jìn)行RFLP分析。CAI^S標(biāo)記揭示的是特異PCR片段的限制性長(zhǎng)度變異的 信息。CAPS是一類共顯性分子標(biāo)記，其優(yōu)點(diǎn)是避免了 RFLP分析中膜轉(zhuǎn)印該一步驟，又能保 持RFLP分析的精確度。另外，由于很多限制性內(nèi)切酶均可參與擴(kuò)增DNA酶切，所W檢測(cè)到 多態(tài)性機(jī)會(huì)較大。
[0004] 利用常規(guī)田間表型鑒定對(duì)抗稻癌病基因的選擇存在很大困難，選擇效率很低，選 擇準(zhǔn)確性很差，而利用抗稻癌病基因連鎖的分子標(biāo)記或者是基因本身特異性標(biāo)記選擇，在 生產(chǎn)上已經(jīng)被證實(shí)是十分有效且經(jīng)濟(jì)的。針對(duì)Pi9基因的分子標(biāo)記選擇，研究者已經(jīng)開發(fā) 了一些標(biāo)記，但它們都存在一些應(yīng)用上的問題或者不便，如位于Pi9基因側(cè)翼的此類分子 標(biāo)記由于和Pi9基因存在一定物理距離，在減數(shù)分裂過程中存在與Pi9基因發(fā)生交換的可 能，從而使選擇不夠準(zhǔn)確；針對(duì)Pi9基因本身的特異性分子標(biāo)記目前有兩例報(bào)道，一例是針 對(duì)Pi9啟動(dòng)子區(qū)域的lObp插入/缺失位點(diǎn)（陳松彪等，2013)，另外一例是針對(duì)Pi9編碼區(qū) 18bp酶切片段差異的dCAI^S標(biāo)記（華麗霞等，2013)，但由于該兩種標(biāo)記差異的片段較小，通 常需要非變性聚丙締酷胺凝膠電泳才能區(qū)分，因此在操作過程中有一些繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是更準(zhǔn)確、快速的鑒定抗稻癌病基因Pi9進(jìn)而篩選W 抗稻癌病植株為親本的后代植株。
[0006] 為了解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種鑒定或輔助鑒定水稻是否含有抗稻癌病 基因Pi9和/或是否具有稻癌病抗性的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中 75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第40804位核巧酸，根據(jù)水稻第6號(hào)染色 體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第40804位核巧酸的種類進(jìn)行鑒定； 如果待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第40804 位核巧酸含T，則待測(cè)水稻為含有抗稻癌病基因Pi9的水稻或候選為含有抗稻癌病基因Pi9 的水稻和/或具有稻癌病抗性的水稻，如果待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序 列或其同源序列自5'末端起第40804位核巧酸不含T，則待測(cè)水稻為不含有抗稻癌病基因 Pi9的水稻或候選為不含有抗稻癌病基因Pi9的水稻。
[0007] 上述方法中，所述待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列 自5'末端起第40804位核巧酸含T具體可為A'或B';
[0008] A'、所述待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端 起第40804位核巧酸為T的純合型；
[0009] B'、所述待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端 起第40804位核巧酸為T和非T的雜合型。
[0010] 上述方法中，所述檢測(cè)待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源 序列自5'末端起第40804位核巧酸的方法如下；W待測(cè)水稻的基因組DNA為模板，W稻 癌病抗性基因Pi9的分子標(biāo)記引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，該P(yáng)CR擴(kuò)增 產(chǎn)物為所述稻癌病抗性基因Pi9的分子標(biāo)記；用限制性核酸內(nèi)切酶甜al酶切所述PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，如果所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能被酶切產(chǎn)生兩個(gè)DNA片段，則待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中 75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第40804位核巧酸含T，如果所述PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物不能被酶切，則待測(cè)水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5' 末端起第40804位核巧酸不含T ;
[0011] 所述引物為能擴(kuò)增所述稻癌病抗性基因Pi9的分子標(biāo)記的引物，所述稻癌病抗性 基因Pi9的分子標(biāo)記的核巧酸序列為如下A所示的序列：
[001引 A、位于水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第 39933位至第41277位核巧酸所示的序列內(nèi)并含有第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列 或其同源序列自5'末端起第40802位至第40807位核巧酸的序列。
[0013] 上述任一所述的方法中，所述A所示的序列為位于水稻第6號(hào)染色體中 75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第40205位至第41006位核巧酸所示的序 列；
[0014] 所述引物為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的DNA分子，所述兩個(gè)DNA片段分 別為長(zhǎng)度為599bp的DNA片段和203bp的DNA片段；
[00巧]所述599bp的DNA片段的序列如SEQ ID No. 5所示；
[0016] 所述203bp的DM片段的序列如SEQ ID No. 6所示。
[0017] 為了解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供擴(kuò)增如下A所示的序列的引物：
[0018] A、位于水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第 39933位至第41277位核巧酸所示的序列內(nèi)并含有第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列 或其同源序列自5'末端起第40802位至第40807位核巧酸的序列。
[0019] 上述引物中，所述A所示的序列為位于水稻第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序 列或其同源序列自5'末端起第40205位至第41006位核巧酸所示的序列；
[0020] 所述引物為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的DNA分子。
[0021] 為了解決W上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供DM片段，選自水稻第6號(hào)染色體中 75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第39933位至第41277位核巧酸所示的序 列內(nèi)并含有第6號(hào)染色體中75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第40802位 至第40807位核巧酸的序列。
[002引上述DNA片段中，所述DNA片段的核巧酸序列為水稻第6號(hào)染色體中 75-1-127BAC12. 1序列或其同源序列自5'末端起第40205位至第41006位核巧酸所示的序 列。
[0023] 上述任一所述的DNA片段為上述稻癌病抗性基因Pi9的分子標(biāo)記，該標(biāo)記為抗稻 癌病基因Pi9的特異性CAI^S標(biāo)記。
[0024] 上述任一所述的方法、引物或DNA片段中所述水稻或待測(cè)水稻為骨干恢復(fù)系水 稻、S系不育系水稻、二系不育系水稻、高抗水稻稻癌病水稻、含有抗稻癌病基因Pi9的水 稻的衍生系、或只轉(zhuǎn)Pi9基因編碼區(qū)的轉(zhuǎn)基因水稻或其衍生系；
[0025] 所述骨干恢復(fù)系水稻具體為?；?38、CDR22、桂99、綿恢725、先恢207、密陽(yáng)46、 93-11、遠(yuǎn)恢2號(hào)和/或蜀恢498 ;<